bFGF-PLGA緩釋微球及其體外釋藥性能研究

武繼民,汪鵬飛,李志宏,袁曉燕

(1.天津大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300072;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所,天津 300161)

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factors,bFGF)是一種具有廣譜作用的促進(jìn)組織或血管形成生長因子[1-2]。bFGF在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中是聯(lián)結(jié)細(xì)胞行為的專一信號(hào)因子,在創(chuàng)傷愈合中起到促血管化的主要作用[3-4],因此bFGF及其制劑的相關(guān)應(yīng)用研究一直是組織工程支架材料、再生醫(yī)學(xué)、創(chuàng)傷治療領(lǐng)域最活躍的課題之一。但是,bFGF作為一種堿性多肽[5],在體內(nèi)擴(kuò)散快、對(duì)熱和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短(3～5 min),因此其生物學(xué)效應(yīng)不能得到充分發(fā)揮。如何有效地發(fā)揮bFGF的生物學(xué)效應(yīng)制約著bFGF的進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用研究,藥劑學(xué)的緩釋技術(shù)較好的解決了這個(gè)問題。通過微球包埋,使bFGF與外界的酶解環(huán)境相對(duì)隔離,能夠在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)緩釋藥物并使局部藥物濃度維持在一個(gè)相當(dāng)?shù)乃健?/p>

本文研究篩選出較理想的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為緩釋載體,通過W1/O/W2溶劑揮發(fā)法(復(fù)乳法),對(duì)bFGF進(jìn)行微納米包埋,制成bFGF-PLGA緩釋微球。并研究了其釋藥行為。

1 材 料

bFGF凍干粉劑(北京雙鷺生物制藥有限公司);PLGA(75/25,相對(duì)分子質(zhì)量5.0萬,山東醫(yī)療器械研究所);聚乙烯醇(PVA,純度:96%～98%,水解度:98%,聚合度:1 750±50,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);bFGF ELISA試劑盒(雙抗夾心96孔,ADL進(jìn)口分裝);二氯甲烷等試劑均為分析純。

JSM-6700F型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(日本);X-520型高速勻漿機(jī)(美國);78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市富華電器廠);CR22G型超速冷凍離心機(jī)(日本);Freezone 6型真空冷凍干燥機(jī)(美國);DH4000A型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特醫(yī)療器械廠);SHA-CA型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);MULTISKAN MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國)。

2 方 法

2.1 bFGF-PLGA微球的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備包埋bFGF的PLGA微球。將水溶性的bFGF溶于生理鹽水中作為內(nèi)水相(W1),PLGA溶于二氯甲烷中作為油相(O),不同濃度、體積的PVA水溶液作為外水相(W2)。將內(nèi)水相逐滴滴入油相中,以高速勻漿機(jī)在30 000 r/min下乳化1 min形成初乳(W1/O),待初乳穩(wěn)定后,將初乳液滴入一定體積不同濃度的PVA水溶液中(W2),15 000 r/min下攪拌3min形成復(fù)乳(W1/O/W2)。然后將復(fù)乳液倒入燒杯中,磁力攪拌揮發(fā)3～5 h,過濾,3 500～5 000 r/min離心15～20 min,去離子水洗滌、過濾后再離心,如此反復(fù)操作3～5遍,直至將多余的PVA清除。將樣品-20℃冷凍保存至少48 h;冷凍干燥24 h,收集微球粉末待用。

2.2 bFGF-PLGA微球表面形貌觀察

將少量的微球粉末放在貼有雙面膠的載玻片上,制成相應(yīng)的掃描電鏡樣品,噴金后利用SEM觀察微球表面形貌。

2.3 ELISA檢測(cè)法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)試,利用抗人bFGF單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的bFGF與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗人bFGF抗體(二抗),它將與結(jié)合在單抗上的人bFGF結(jié)合而形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與二抗的生物素結(jié)合,加入TMB顯色。在450 nm波長處測(cè)定吸光度(A)值,bFGF濃度與A值成正比,可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中bFGF濃度。

作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底;如果標(biāo)本用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋,也要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底,如果樣品未用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋,不需扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底。以濃度分別為600,300,150,75,37.5,18.75,9.38,0 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),以與之對(duì)應(yīng)的A值為縱坐標(biāo),作圖建立bFGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出標(biāo)準(zhǔn)方程。然后根據(jù)樣品A值在該曲線圖上查出bFGF濃度。

2.4 微球中bFGF的載藥量和包封率測(cè)定

稱取微球20mg,加入二氯甲烷2mL中,使其完全溶解,再加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)1mL,充分?jǐn)嚢?、靜置、分液,收集水相凍存,ELISA法測(cè)定樣品A值。根據(jù)樣品A值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液中bFGF的濃度,從而計(jì)算出測(cè)試微球中的bFGF含量。載藥量=(微球中bFGF質(zhì)量/微球總質(zhì)量)×100%;包封率=(微球中 bFGF質(zhì)量/投入bFGF總質(zhì)量)×100%。

2.5 微球中bFGF的體外釋放行為研究

稱取微球50mg裝入釋放管中,以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)10mL為釋放介質(zhì),于37℃振蕩速度為100 r/min的水浴恒溫振蕩器中,分別在0.5,1,2,3,5,8,12,17,23,30,45 d取出釋放介質(zhì)2mL于離心管中標(biāo)號(hào)凍存待測(cè)并及時(shí)加入同樣體積的釋放介質(zhì)。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出微球中bFGF的釋放量,并計(jì)算累積釋放率,得到微球中bFGF的體外釋放曲線。突釋率為微球中藥物在第1天的累積釋放率。

3 結(jié) 果

3.1 微球的形態(tài)與粒徑

經(jīng)SEM觀察,bFGF-PLGA微球表面光滑無孔隙,球形好;形態(tài)及粒徑大小較均勻。如圖1所示。微球粒徑為(0.75±0.08)μm。

圖1 bFGF-PLGA微球表觀形貌SEM圖Fig.1 SEM image of bFGF-PLGA microspheres

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:C=322.58 A-87.68,r2=0.919 9。

3.3 微球載藥量、包封率及體外釋藥行為

5批次測(cè)定結(jié)果見表1。bFGF-PLGA緩釋微球載藥量和包封率平均值分別為(59.9×10-3)%和79.9%,微球的突釋率均值為20.0%。微球在45 d內(nèi),能夠持續(xù)釋放bFGF,且釋放濃度比較穩(wěn)定。將上述5批試樣混合后經(jīng)檢測(cè),45 d微球中bFGF的累積釋放率達(dá)80%。bFGF微球的體外釋藥曲線也顯示,bFGF-PLGA緩釋微球能夠體外持續(xù)釋藥,具有明顯的緩釋作用(圖2)。

表1 bFGF-PLGA緩釋微球載藥量、包封率和突釋率Tab.1 Drug loading amount,encapsulation efficiency and initial burst release percentage of bFGF-PLGA microspheres

圖2 bFGF-PLGA微球的體外釋藥曲線Fig.2 In vitro release profile of bFGF-PLGA microspheres

4 討 論

bFGF作為一種廣泛存在于人體各組織中但含量極微的生物活性物質(zhì),主要作用于中胚層組織與神經(jīng)外胚層組織和細(xì)胞,能夠促進(jìn)多種細(xì)胞分裂增值,促進(jìn)微血管分化,使局部毛細(xì)血管增加,改善血液循環(huán),刺激骨細(xì)胞DNA合成和增值,增加骨細(xì)胞合成膠原和非膠原蛋白的能力,誘導(dǎo)胚胎發(fā)育[6]。因此,bFGF能夠有效地促進(jìn)骨、軟骨、肌腱、皮膚、血管、韌帶和中樞神經(jīng)等多種組織的創(chuàng)傷修復(fù);并且與腫瘤的生長、增殖及一些神經(jīng)性系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系[7]。

本研究制備的bFGF-PLGA緩釋微球,使其在創(chuàng)傷初期修復(fù)階段,持續(xù)在組織局部釋放bFGF,并維持在有效生理濃度,以顯著促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)。本研究以PLGA為載體材料,應(yīng)用單因素設(shè)計(jì)+正交設(shè)計(jì)進(jìn)行bFGF微球制備工藝優(yōu)化,結(jié)果顯示,bFGF-PLGA緩釋微球表面光滑圓整,球體均勻性較好,微球凍干后呈疏松白色粉末,再分散性良好,可在常規(guī)條件下進(jìn)行分裝。

一般認(rèn)為,緩釋制劑在突釋期內(nèi)釋放的藥物量應(yīng)占總量的20%左右,且藥物釋放曲線平滑,沒有過大的波動(dòng)[8]。本研究顯示,微球的體外釋藥規(guī)律符合Higuichi方程,突釋率均值為20.0%,45 d后累積釋放量達(dá)到80%,且其濃度保持在一定的水平。因此,在45 d內(nèi)bFGF微球體外緩釋作用明顯,并且釋出bFGF濃度變化不大,實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較理想。

總之,本研究所制備的bFGF-PLGA緩釋微球有望發(fā)展成為一種具有對(duì)bFGF進(jìn)行中長期緩釋功能的藥物載體,為研制符合臨床治療需要的中長效注射劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),若bFGF-PLGA緩釋微球引入支架材料,將有效促進(jìn)血管化[9-10],在組織工程研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Tabata Y.Tissue regeneration based on growth factor release[J].Tissue Eng,2003,9(Suppl 1):S5-S15.

[2]Detillieux K A,Cattini PA,Karadami E.Beyond angiogenesis:the cardioprotective potential of fibroblast growth factor-2[J].Can J Physiol Pharmacol,2004,82:1044-1052.

[3]Bosman F T,Stamenkovic I.Functional structure and composition of the extracellular matrix[J].JPathol,2003,200:423-428.

[4]Layman H,Li S,Pham SM,etal.Therapeutic angiogenesisin critical limb ischemia via the localized delivery of bFGF from ionic hydrogels[J].J Surg Res,2006,130:265-270.

[5]Kinsella L,Chen H L,Smith JA,et a1.Interactions of putative heparin-binding domains of basic fibroblast growth factor and its receptor,FGFR-1,with heparin using synthetic peptides[J].Glycoconj J,1998,15:419-422.

[6]尹慧君,蘇佳燦.堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)骨折愈合的作用及機(jī)制[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(3):329-330.

[7]Daniel B P,Shenshen C.Heparin-regulated release of growth factor in vivo and angiogenic response in vivo to implanted hydrogels containing VEGF and bFGF[J].Biomaterials,2006,(27):5242-5251.

[8]陳志奎,林禮務(wù),林琦,等.眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素緩釋微球制備及體外性質(zhì)研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(3):161-164.

[9]Jaklenec A,Wan E,Murray M E,etal.Novel scaffolds fabricated from protein-loaded microspheres for tissue engineering[J].Biomaterials,2008,29:185-192.

[10]Bae S E,Son JS,Park K D,etal.Fabrication of covered porous PLGA microspheresusing hydrogen peroxide for controlled drug delivery and regenerativemedicine[J].JControlled Release,2009,133:37-43.