兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定①

陳宣維 林文平 林建華

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 福建 福州 350005)

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Marrow stromal cells,MSC) 是在骨髓中存在的一類具有多向分化潛能的細(xì)胞總稱,可以向成骨系細(xì)胞、成軟骨系細(xì)胞、成纖維系細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化[1],因其取材方便、損傷小、體外繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn),已成為組織工程種子細(xì)胞的首選[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮⑼肕SC的體外培養(yǎng)體系,觀察MSC的形態(tài)和生長(zhǎng)情況,檢測(cè)其表面標(biāo)志,為以MSC為基礎(chǔ)的骨組織工程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

新西蘭大白兔(福建醫(yī)科大學(xué)大學(xué)動(dòng)物中心);DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清(Hyclon公司);0.25%胰酶加EDTA(Gibco公司);Percoll分離液(Sigma 公司);超凈工作臺(tái)(DCM-1300,蘇州);自動(dòng)臺(tái)式離心機(jī)(LD25-2,北京);CO2孵箱(Thermo forma 311,美國(guó));倒置顯微鏡(Olympus);透射電鏡(HU-12A,日立公司);細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(Sigma 公司);熒光標(biāo)記CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC單克隆抗體(美國(guó)PharMingen 公司);流式細(xì)胞儀(Beckman counter Epics XL,美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔MSC的原代培養(yǎng) 新西蘭大白兔(福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),6周齡,體重約1.5kg,雌雄不限。3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉,于無(wú)菌條件下在雙側(cè)坐骨棘處用18號(hào)骨髓穿刺針接5mL注射器,內(nèi)含肝素鈉0.2mL(100U/mL),各抽吸骨髓液2mL,抽吸完畢迅速將注射器內(nèi)液體均勻混合,注入培養(yǎng)皿,用1mL注射器反復(fù)吹打培養(yǎng)皿中的骨髓液約5min,置入離心管,1000r/min離心10min,棄去脂肪和上清,用PBS重懸制成細(xì)胞懸液,小心加入至2倍體積1.073g/mL的Percoll分離液上層,室溫下以2000r/min離心25min。收集中間乳白色的有核細(xì)胞層,再用PBS洗滌2次,加入適量的含雙抗的20%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液,置于離心管中,1000 r/min 離心15min。棄上清液,加入3mL含雙抗的20%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液,反復(fù)吹打,稀釋成細(xì)胞懸液,以1.0×104/cm2接種于50cm2培養(yǎng)瓶中。于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3d后首次半量換液,將未貼壁的細(xì)胞全部棄掉,以后每2～3d全量換液1次。

圖1 家兔MSC原代培養(yǎng)9天(X100)

圖2 家兔MSC透射電鏡觀察(X10000)

1.2.2 兔MSC的傳代 在原代培養(yǎng)的細(xì)胞接近鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,倒置顯微鏡觀察,待50%細(xì)胞變?yōu)閳A形時(shí),將胰酶倒掉,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化,再以1×104/cm2傳代培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 每天在倒置相差顯微鏡下觀察MSC原代和傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征,并適時(shí)拍照。

1.2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 細(xì)胞在培養(yǎng)皿中增殖滿單層后,0.25% 胰蛋白酶消化,移入離心管,1000r/min離心5min,洗滌細(xì)胞2次,末次離心后棄上清,取樣行透射電鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兔MSC的表面標(biāo)志 取第3代MSC用PBS 重新懸浮后,調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/cm2,取100μL細(xì)胞懸液與CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC單抗室溫避光孵育30min后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MSC的生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

骨髓細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心后,接種于50cm2的培養(yǎng)瓶,倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)液中存在大量大小不一的圓形細(xì)胞;24h后可見(jiàn)多數(shù)貼壁的圓形細(xì)胞中散在有少數(shù)多角形或短梭形細(xì)胞,有數(shù)個(gè)突起類似成纖維細(xì)胞;3～4d后梭形細(xì)胞和多角形細(xì)胞顯著增多;5～6d后形成細(xì)胞集落方式生長(zhǎng),數(shù)量明顯增多,呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形、紡錘形,細(xì)胞輪廓清晰,排列較緊密;7～9d后,細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯加速,逐步形成大小不一、分散的細(xì)胞集落,呈放射狀向四周擴(kuò)展,細(xì)胞呈漩渦狀或平行排列(圖1);第10～12天,貼壁單層生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底,放射狀或漩渦狀生長(zhǎng)方式更趨明顯,非貼壁細(xì)胞通過(guò)換液己逐漸被清除,基本完成原代單層生長(zhǎng)。傳代細(xì)胞的細(xì)胞貼壁時(shí)間和增殖速度比原代培養(yǎng)要快,大約2h開始貼壁,培養(yǎng)約8～11d互相接觸形成單層。傳代細(xì)胞分裂相多見(jiàn),胞體大,細(xì)胞邊界不清楚,胞漿內(nèi)顆粒多,顯示細(xì)胞功能活躍,處于活躍的基質(zhì)合成狀態(tài)。傳代至第10代后,細(xì)胞增殖速度減慢,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多樣性,逐漸呈老化現(xiàn)象。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代MSC的細(xì)胞表面標(biāo)記

2.2 MSC透射電鏡觀察

透射電鏡示:細(xì)胞胞體較大,表面有微絨毛,核大而不規(guī)則,核內(nèi)以常染色質(zhì)為主,核仁可見(jiàn),部分細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)核仁。胞漿內(nèi)見(jiàn)中等量線粒體,其體積較小,密度較高,可見(jiàn)中等量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)束狀擴(kuò)張,可見(jiàn)少量高爾基復(fù)合體,有些細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多次級(jí)溶酶體,細(xì)胞間未見(jiàn)連接(圖2)。

2.3 MSC的表面抗原鑒定

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞樣本(圖3),CD34、CD45、CD29、CD90分別為0.79%、0.18%、96.8%、84.2%。CD34、CD45基本不表達(dá),證實(shí)這些細(xì)胞是非造血干細(xì)胞;CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性,表明分離的細(xì)胞具有MSC的特征。

(1)CD34檢測(cè)為陰性;(2)CD45檢測(cè)為陰性;(3)CD29檢測(cè)為陽(yáng)性;(4)CD90檢測(cè)為陽(yáng)性。

3 討論

MSC是一種存在于骨髓的非造血干細(xì)胞,骨髓中絕大多數(shù)是造血干細(xì)胞,MSC的數(shù)量較少,一般認(rèn)為MSC只占骨髓有核細(xì)胞的1/104～1/105[3～4],為了得到組織工程學(xué)需要的單一細(xì)胞,人們嘗試用各種方法分離、純化MSC。目前用于分離MSC 的方法主要有貼壁篩選法和密度梯度離心法[5]。貼壁篩選法是根據(jù)MSC貼壁生長(zhǎng),而造血系細(xì)胞等因無(wú)法貼壁,則隨培養(yǎng)液的更換而被清除[6]。但是,由此獲得的MSC純度不高,混合有較多的雜細(xì)胞,比如成纖維細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞等,所以體外培養(yǎng)特性不穩(wěn)定[7]。密度梯度離心法是利用MSC與骨髓中其他細(xì)胞的密度不同,用特定密度的淋巴細(xì)胞分離液將MSC分離出來(lái)。這種方法應(yīng)用梯度離心分離細(xì)胞,骨髓中的細(xì)胞按密度差別得以分離,所以可快速獲得大量的高純度細(xì)胞[8]。本實(shí)驗(yàn)用密度梯度離心法來(lái)分離培養(yǎng)MSC取得較好的效果。

目前尚沒(méi)有十分理想的方法來(lái)鑒定MSC,主要通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征如呈紡錘形、貼壁、成集落生長(zhǎng)以及作為干細(xì)胞多分化潛能的確定(在不同的條件下,向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化的特性)來(lái)證明其干細(xì)胞的屬性。我們分離培養(yǎng)的MSC從顯微鏡下觀察,90%以上為梭形或呈紡錘形的細(xì)胞;電鏡觀察,細(xì)胞表面有微絨毛結(jié)構(gòu),細(xì)胞核大,核漿比例較正常細(xì)胞大,胞漿內(nèi)細(xì)胞器以線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體為主,說(shuō)明細(xì)胞蛋白合成和分泌能力旺盛,能夠大量攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),功能活躍,顯示了干細(xì)胞的幼稚特性,與成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞等明顯不同,這和文獻(xiàn)相一致[9]。Pittenger等[10]認(rèn)為,MSC細(xì)胞體積小,核漿比大,不表達(dá)分化相關(guān)標(biāo)志如I、II、III型膠原、堿性磷酸酶和osteopontin;在細(xì)胞貼壁附著后則細(xì)胞均一致地表達(dá)SH2,SH3CD29,CD44,CD71,CD90,CD106,CD120a,CD124等多種表面蛋白。MSC缺乏造血干細(xì)胞標(biāo)記,不表達(dá)造血細(xì)胞抗原,如造血前提細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34,白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45,淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a,單核巨噬細(xì)胞表面抗原CD14,同時(shí)不表達(dá)分化抗原HLA-DR[10～11]。我們采用1.073g/mLPercoll密度梯度分離法,從兔骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞,3d后首次半量換液,經(jīng)多次換液,去除大量為貼壁的雜細(xì)胞,7～9d后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,漩渦狀生長(zhǎng)。經(jīng)傳代細(xì)胞逐漸純化,至3代時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)的細(xì)胞只表達(dá)CD29和CD90,而CD34、CD45均呈陰性表達(dá),這表明我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞是成分較為單一的MSC,而不是造血干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。

總之,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用本實(shí)驗(yàn)方法提取、純化和擴(kuò)增的MSC,MSC增殖能力較強(qiáng),純度高,可以作為組織工程的種子細(xì)胞,為組織工程骨的構(gòu)建提供依據(jù)。

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