注射用復(fù)方甘草酸苷細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

馬建麗，樸晉華，陳新文，周 亮 (解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 00048;山西省藥品檢驗(yàn)所)

注射用復(fù)方甘草酸苷是由甘草酸苷、甘氨酸和鹽酸半胱氨酸組成的復(fù)方制劑，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制病毒增殖及滅活病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶和改善肝組織損傷等作用。該藥具有較強(qiáng)的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)活性及皮質(zhì)激素樣作用，并且取得了良好的療效。臨床用于治療慢性肝病，改善肝功能異常，亦可用于治療濕疹、皮膚炎、蕁麻疹。為了保證臨床用藥安全，本文依據(jù)中國(guó)藥典2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［1，2］，對(duì)應(yīng)用鱟試劑檢測(cè)注射用復(fù)方甘草酸苷中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性進(jìn)行了方法學(xué)研究，并給出了細(xì)菌內(nèi)毒素限值，為其質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，該法具有靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)便、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，便于藥品生產(chǎn)流通各個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)控。

1 材料

1.1 試藥 鱟試劑(TAL)有2種:①湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)0802290，靈敏度為0.25 EU/ml，0.1 ml/支;② 廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號(hào)090741，靈敏度為0.125 EU/ml，0.1 ml/支。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)2009－65，180 EU/支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)W2008-4，10 ml/支);注射用復(fù)方甘草酸苷(四環(huán)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):200905262、200905312、200907182，規(guī)格為 80 mg/支)。

1.2 儀器 電熱恒溫水浴箱，北京市醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào):GSY-Ⅱ;漩渦混合器，上海環(huán)球物化儀器廠，型號(hào):WH-861。

2 方法

2.1 內(nèi)毒素限值(L)的確定 按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值公式L=K/M，其中K為按規(guī)定的給藥途徑下，人用每千克重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑量為5.0 EU/(kg·h)，M為人用每小時(shí)每千克重的最大劑量。本品成人通常1次/d，80－120 mg靜脈注射或靜脈滴注，可依年齡、癥狀適當(dāng)增減，增量時(shí)用藥劑量限度為200 mg/d。按臨床劑量一次200 mg 甘草酸苷計(jì)算，L=K/M=5.0 EU/(kg·h)/200 mg/(60 kg·h)=1.5 EU/mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核 按中國(guó)藥典2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，所用鱟試劑靈敏度均在0.5λ－2.0λ范圍內(nèi)時(shí)，符合規(guī)定，可用于本試驗(yàn)。

2.3 最小有效稀釋濃度(MVC)的計(jì)算 按公式MVC=λ/L計(jì)算，其中L為本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值;λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5－0.03 EU/ml，則本品對(duì)應(yīng)的有效稀釋濃度為:0.33－0.02 mg/ml。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn) 將供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成 2，1，0.5，0.25，0.12，0.06，0.03 mg/ml的供試品溶液，將此系列濃度溶液記為供試品溶液組(NPC)，另配制兩組同系列濃度的供試液，使其中一組每一濃度的供試液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為供試品1(PPC1)，另一組含有0.25 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記為供試品2(PPC2)。取靈敏度為0.25 EU/ml和0.125 EU/ml兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC1、PPC2、NPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照記為PC和陰性對(duì)照記為NC。

2.5 供試品干擾試驗(yàn) 取3批注射用復(fù)方甘草酸苷，用BET水分別稀釋至0.25 mg/ml，用該濃度溶液和BET水分別將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.03 EU/ml的一系列濃度，與兩個(gè)廠家靈敏度分別為 0.25 EU/ml、0.125 EU/ml的鱟試劑反應(yīng)，每一濃度做4管，同時(shí)作陰性對(duì)照，37℃孵育60 min后觀察結(jié)果，當(dāng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)(Es)值在0.5λ－2.0λ(包括0.5λ 和2.0λ)時(shí)，而供試品溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度(Et)值在0.5－2.0Es(包括0.5Es和 2.0Es)時(shí)，即無(wú)干擾作用，反之，則有。

2.6 供試品限量檢查試驗(yàn) 根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，本品采用上述制定的限值進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。分別選用兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑，按照中國(guó)藥典2005年版附錄ⅪE進(jìn)行供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

3 結(jié)果

3.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查λc與λ一致，均符合規(guī)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 供試品干擾預(yù)試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示注射用復(fù)方甘草酸苷在0.5 mg/ml及其以下濃度時(shí)對(duì)鱟試劑的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 供試品干擾試驗(yàn) 注射用復(fù)方甘草酸苷在0.25 mg/ml濃度時(shí)對(duì)兩個(gè)廠家鱟試劑的凝集反應(yīng)確無(wú)增強(qiáng)或抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 供試品限量檢查試驗(yàn) 用兩個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)本品連續(xù)3個(gè)批號(hào)進(jìn)行了內(nèi)毒素限量檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核Tab 1 Confirmation of labeled TAL reagent sensitivity

表2 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of interference pretest

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of interference test

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素限量檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacterial endotoxin limit test

4 討論

4.1 復(fù)方甘草酸苷可以抑制TAL細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)，但通過(guò)稀釋可消除干擾。由干擾預(yù)試驗(yàn)可知，將粉針劑稀釋至0.5 mg/ml及以下濃度時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)無(wú)干擾作用，且兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑反應(yīng)結(jié)果一致。

4.2 正式干擾試驗(yàn)用靈敏度為 0.25 EU/ml、0.125 EU/ml兩個(gè)廠家的 TAL，對(duì)3批稀釋濃度為0.25 mg/ml注射用復(fù)方甘草酸苷進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾試驗(yàn)，結(jié)果本品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL的反應(yīng)無(wú)干擾作用。

4.3 試驗(yàn)結(jié)果證明，注射用復(fù)方甘草酸苷細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為1.5 EU/mg，據(jù)此建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可行，且方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄85.

［2］ 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［M］.北京:醫(yī)藥科技出版社，2005:287.