過敏原小麥醇溶蛋白的ELISA定量檢測方法的建立

秦倩茹，高宏偉，馬洪明，*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東青島266002）

過敏原小麥醇溶蛋白的ELISA定量檢測方法的建立

秦倩茹1，高宏偉2，馬洪明1，*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東青島266002）

建立了檢測小麥過敏原醇溶蛋白的定量ELISA抗體夾心法，以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白單抗包被酶標(biāo)板，HRP標(biāo)記兔抗醇溶蛋白抗體作為酶標(biāo)抗體，工作濃度為1∶8000，將醇溶蛋白精確配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測醇溶蛋白的含量。最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2≥0.99，定量檢測限為19.53ng/mL，對(duì)應(yīng)的食品樣品檢測限為7. 81ppm。樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，實(shí)驗(yàn)內(nèi)CV為3.07%～5.91%，實(shí)驗(yàn)間CV為0.26%～5.24%，僅對(duì)大麥有一定的交叉反應(yīng)，可在4℃放置兩周。本法準(zhǔn)確度和精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，特異性較強(qiáng)，適用于食品過敏原小麥醇溶蛋白的檢測。

醇溶蛋白，ELISA，定量檢測

醇溶蛋白（gliadin）是分子量28～55kDa的單體蛋白質(zhì)，是小麥蛋白的主要成分，占蛋白總含量的40%，主要以貯藏蛋白形式存在于小麥胚乳中，溶于60%～70%的乙醇。在低pH條件下，根據(jù)在電泳圖譜上的遷移率不同，主要分為α-、β-、γ-和ω-四種類型，它們分別占醇溶蛋白總量的25%、30%、30%和15%［1］。根據(jù)完全和部分氨基酸序列分析，它們能分為四組不同的類型：ω5-、ω1，2-、α/β-和γ-醇溶蛋白［2］。醇溶蛋白是小麥等谷物類的主要過敏原，小麥過敏會(huì)影響皮膚、內(nèi)臟、呼吸道的健康，引起運(yùn)動(dòng)激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻癥、乳糜瀉腸炎、麻風(fēng)皮膚病等［1］。乳糜瀉腸炎是遺傳易感患者攝入小麥麩質(zhì)后不能耐受所致的慢性小腸吸收不良綜合癥，并且目前認(rèn)為醇溶蛋白是乳糜瀉患者的主要誘因。Codex Alimentarius（Alinorm 08/31/26）定義無麩食品為麩質(zhì)含量低于20ppm的食品，而醇溶蛋白約占麩質(zhì)含量的一半，所以檢測醇溶蛋白的含量應(yīng)低于10ppm。因此，需要建立一種有效檢測過敏原醇溶蛋白的方法，檢測食品中醇溶蛋白的含量，既符合美國《食物過敏原標(biāo)簽及消費(fèi)者保護(hù)法》的要求，也為患者健康提供保障。本文針對(duì)醇溶蛋白含量建立了ELISA雙抗體夾心定量快速檢測方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醇溶蛋白、TMB底物、HRP標(biāo)記兔抗醇溶蛋白抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG SIGMA公司；鼠抗醇溶蛋白單克隆抗體 德國ZEDIRA公司；牛血清蛋白BSA Solarbio公司；酪蛋白胨 青島海博公司；特級(jí)胎牛血清FBS 北京元亨圣馬公司；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；酶聯(lián)檢測儀（BIO-RAD 680）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品的前處理［3］

樣品依次為：富凱小麥胚芽，宏光麥仁，宏光小麥，宏光大麥，宏光燕麥米，宏光燕麥片，宏光蕎麥米，宏光長粒糯米，宏光圓粒糯米，宏光黑香米，宏光薏仁米，宏光大黃米，宏光西米，宏光糙米，宏光高粱米，宏光玉米面，君盛爽滑蛋面。

將樣品研磨成細(xì)粉，精確稱取100mg，溶于1mL 65%的乙醇，即按照1∶10稀釋?；靹颍?℃過夜提取醇溶蛋白，4000r/min離心20min，取上清，上清用樣品稀釋液（即封閉液）稀釋一定倍數(shù)，用于雙抗體夾心ELISA檢測。

醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的配制：取SIGMA公司的粗提麥醇溶蛋白100mg，溶于100mL 65%的乙醇，溶解成1mg/mL的母液，分裝凍存。母液用樣品稀釋液精確稀釋成所需的濃度。

1.3 包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適濃度的確定

首先以ELISA直接法做單因素實(shí)驗(yàn)，分別初步測定包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，然后按照單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)陌豢贵w濃度和酶標(biāo)抗體濃度，按照方陣滴定法，設(shè)置陽性對(duì)照（10000ng/mL醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對(duì)照（0ng/mL醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品），進(jìn)一步確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適濃度。

1.4 封閉液的選擇

根據(jù)確定的包被抗體和酶標(biāo)抗體濃度，選擇不同配方的封閉液，主要是以胎牛血清、牛血清蛋白、酪蛋白和蔗糖為主，溶解在0.01mol/L pH7.4的PBS或加入Tween20的PBS中的不同組合的封閉液。分別設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以陰性值小于0.1、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照比值（P/N）最大者為合適的封閉液。

1.5 ELISA雙抗體夾心法

1.5.1 包被 用包被液（0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液）將鼠抗醇溶蛋白單抗稀釋至包被濃度，以100μL/孔加入酶標(biāo)板中，置4℃過夜。

1.5.2 洗板 棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，用PBS/T20洗板3次，每次3min，拍干。

1.5.3 封閉 用濃度為10%的FBS-PBS/T20封閉游離結(jié)合位點(diǎn)，每孔100μL，37℃溫育1h，洗板。

1.5.4 加入待測抗原 用樣品稀釋液將醇溶蛋白母液作梯度稀釋，待測樣品作適當(dāng)稀釋，每孔100μL，并設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃溫育1h，洗板。

1.5.5 加入酶標(biāo)抗體 將酶標(biāo)記兔抗醇溶蛋白抗體稀釋至工作濃度，每孔加100μL，新鮮配制，37℃溫育45～60min。

1.5.6 顯色 各孔加TMB（3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺）底物液100μL，室溫避光反應(yīng)10～15min。

1.5.7 終止 各孔加2mol/L硫酸50μL終止反應(yīng)。

1.5.8 讀數(shù) 用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光值A(chǔ)，以陰性對(duì)照孔調(diào)零，以醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液A值及相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)作直線回歸，得回歸方程，將待測樣品A值代入回歸方程求出相應(yīng)的醇溶蛋白含量。

1.6 方法驗(yàn)證

1.6.1 醇溶蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1mg/mL醇溶蛋白母液精確稀釋成4.88、9.77、19.53、39.06、78.13、156.25、312.5、625、1250、2500、5000、10000、20000ng/mL一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的A值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)直線回歸方程計(jì)算待測樣品中的醇溶蛋白含量。

1.6.2 精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性驗(yàn)證 在檢測范圍內(nèi)將醇溶蛋白母液精確稀釋成一定濃度，每一濃度重復(fù)測定6次，另外在三次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度重復(fù)測定6次。分別取測定結(jié)果的平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算醇溶蛋白含量的測定值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差（S）、變異系數(shù)（CV%）和回收率（%），評(píng)價(jià)此方法的精密性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1.6.3 特異性驗(yàn)證 按照1.2樣品處理方法處理樣品1～16，上清用樣品稀釋液稀釋40倍，檢測A值，與陰性對(duì)照比較，以P/N≥2.1為陽性。陽性為有交叉反應(yīng)，陰性為無交叉反應(yīng)。

1.6.4 穩(wěn)定性驗(yàn)證 將本實(shí)驗(yàn)的試劑配制成試劑盒，分別在4℃放置7、10、14d，按照上述ELISA檢測方法測定醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品A值，相比較觀察試劑的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適濃度

2.1.1 酶標(biāo)抗體濃度的初步確定 以10μg/mL醇溶蛋白包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)記兔抗醇溶蛋白抗體從1∶100的稀釋濃度開始，按2n倍比稀釋成不同濃度，以ELISA直接法的單因素實(shí)驗(yàn)測定450nm處的A值。取A值為1.0時(shí)的稀釋度作為酶標(biāo)抗體的工作濃度［4］，當(dāng)稀釋度為6～7時(shí)符合條件，所以酶標(biāo)記抗體的工作濃度約為1∶6400～1∶12800。

2.1.2 包被抗體濃度的初步確定 選擇鼠抗醇溶蛋白單抗的初始濃度為40μg/mL，按2n倍比稀釋成不同濃度包被酶標(biāo)板，加入工作濃度為1∶5000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，以ELISA直接法測定450nm處的A值?？梢缘贸?，鼠抗醇溶蛋白單抗包被濃度由40μg/mL降至1.25μg/mL時(shí)，A值變化不大；降至1.25μg/mL以下時(shí)，A值隨之明顯降低。說明抗醇溶蛋白單抗的濃度達(dá)到約1.25μg/mL時(shí)，酶標(biāo)板達(dá)到最大包被吸附量，此時(shí)能夠最大量的捕獲目的蛋白。因此，初步確定包被抗體的工作濃度為1.25μg/mL左右。

2.1.3 包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適濃度 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇包被抗體濃度為1、2、4μg/mL包被酶標(biāo)板，酶標(biāo)抗體濃度為1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶12000，分別設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以方陣滴定法測定結(jié)果顯示，包被抗體濃度為2μg/mL，酶標(biāo)抗體濃度為1∶8000時(shí)，陰性對(duì)照值為0.08，陽性對(duì)照與陰性對(duì)照相差最大，為最適的包被抗體和酶標(biāo)抗體濃度配伍。

表1 9種配方封閉液的封閉效果

表2 ELISA的準(zhǔn)確度、精確度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.2 封閉液選擇

選擇合適的封閉液，能夠有效減小背景信號(hào)的干擾，增強(qiáng)陽性樣品的信號(hào)，即減少非特異性反應(yīng)［5］。在最適的包被抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度下，選擇9種配方的封閉液，分別做抗體夾心ELISA檢測的A值如表1。顯然，以10%FBS（PBS/T20溶解）做封閉液，陰性值最低，陰陽性差別最大，封閉效果最好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和檢測限

將4.88～20000ng/mL的醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在所建立的抗體夾心ELISA法中檢測，每個(gè)濃度檢測3次，取A值的平均值與對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)進(jìn)行線性分析，結(jié)果顯示最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2= 0.9957，定量檢測限為19.53ng/mL。

圖1 醇溶蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性驗(yàn)證

在檢測范圍內(nèi)將醇溶蛋白母液精確稀釋成1000、500、50ng/mL，每一濃度重復(fù)測定6次，另外在三次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度重復(fù)測定6次。分別取測定結(jié)果的平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算醇溶蛋白含量的測定值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差（S）、變異系數(shù)（CV%）和回收率（%），結(jié)果如表2。在同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)，樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，說明本法準(zhǔn)確度比較高。同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)精密度CV為3.07%～5.91%，3次實(shí)驗(yàn)間精密度CV為0.26%～5.24%，說明本法精密度較高，重復(fù)性較好。

2.5 特異性驗(yàn)證

按照1.2樣品處理方法處理樣品1～16，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的定量檢測限19.53ng/mL，上清用樣品稀釋液稀釋50倍，相當(dāng)于原始樣品稀釋了500倍，檢測限19.53ng/mL乘以稀釋倍數(shù)后，約為7.81μg/mL，即7.81ppm，屬于無麩質(zhì)范圍。因此，樣品測定的A值在檢測限以下，即P/N＜2.1，均判定為陰性，以P/N≥2.1為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

富凱小麥胚芽，宏光麥仁，宏光小麥為強(qiáng)陽性，宏光大麥表現(xiàn)為陽性。

宏光燕麥米，宏光燕麥片，宏光糙米，宏光玉米面均為弱陽性，帶入回歸方程計(jì)算出含量均小于10ppm。

宏光蕎麥米，宏光長粒糯米，宏光圓粒糯米，宏光黑香米，宏光薏仁米，宏光大黃米，宏光西米，宏光高粱米均為陰性。

說明本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥醇溶蛋白有較強(qiáng)的特異性，但對(duì)大麥有一定的交叉反應(yīng)。

2.6 穩(wěn)定性驗(yàn)證

將本實(shí)驗(yàn)的試劑配制成試劑盒，分別在4℃放置7、10、14d后測定，對(duì)于500ng/mL和50ng/mL濃度的醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別測定6次，回收率在92.58%～114.84%之間，回歸方程的R2在0.9817～0.9984之間，CV為3.52%～5.95%之間。并且本實(shí)驗(yàn)用的抗體、醇溶蛋白母液等試劑原液在4℃放置1個(gè)月，效價(jià)均沒有降低，表明本實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較好。

2.7 試劑盒應(yīng)用

取樣品宏光小麥、宏光大麥、宏光燕麥片、宏光玉米面、君盛爽滑蛋面，按照上述1.2樣品處理方法處理后，用樣品稀釋液稀釋50倍，每份樣品做6次測定，帶回標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中醇溶蛋白含量，乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實(shí)際醇溶蛋白含量（表3）。

表3 實(shí)測陽性樣品的實(shí)際醇溶蛋白含量

3 結(jié)論

應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測麥醇溶蛋白，為食品中醇溶蛋白的定量檢測提供了簡便快速的手段。醇溶蛋白作為小麥麩質(zhì)的主要蛋白質(zhì)，約占麩質(zhì)蛋白含量的一半，定量檢測醇溶蛋白的含量，能估算出麩質(zhì)蛋白的含量，從而根據(jù)無麩食品定義以20ppm為界限，應(yīng)美國《食物過敏原標(biāo)簽及消費(fèi)者保護(hù)法》的要求，在食品標(biāo)簽上標(biāo)識(shí)是否為無麩食品。乳糜瀉患者從此可以根據(jù)標(biāo)簽標(biāo)識(shí)選擇可以食用的食品。

目前，國內(nèi)外檢測醇溶蛋白主要采用ELISA方法，而市面上大部分銷售的都是檢測人血清中抗醇溶蛋白抗體的ELISA試劑盒，只能在醫(yī)學(xué)診斷層面上檢測患者血清，確定患者是否患乳糜瀉病。而從預(yù)防角度上，檢測食品中的醇溶蛋白，只有國外的商品化ELISA試劑盒，但是價(jià)格非常昂貴。國內(nèi)目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化和商品化的檢測醇溶蛋白的ELISA試劑盒。因此，需要建立一種有效的定量檢測過敏原醇溶蛋白的方法，為ELISA試劑盒的研制提供理論依據(jù)，彌補(bǔ)國內(nèi)商品化ELISA試劑盒的空缺。

本文所建立的抗體夾心ELISA法，以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白單抗包被酶標(biāo)板，1∶8000的HRP標(biāo)記兔抗醇溶蛋白抗體作為酶標(biāo)抗體，檢測小麥醇溶蛋白含量的最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2≥0.99，定量檢測限為19.53ng/mL，對(duì)應(yīng)的食品樣品檢測限為7.81ppm。樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，實(shí)驗(yàn)內(nèi) CV為3.07%～5.91%，實(shí)驗(yàn)間CV為0.26%～5.24%，但對(duì)大麥有一定的交叉反應(yīng)性，可在4℃放置兩周，穩(wěn)定性較好。本實(shí)驗(yàn)的初步驗(yàn)證表明，本法準(zhǔn)確度和精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，特異性較強(qiáng)，為進(jìn)一步研制醇溶蛋白ELISA定量檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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Quantitative determination of gliadin protein from wheat in foods by ELISA method

QIN Qian-ru1，GAO Hong-wei2，MA Hong-ming1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Shandong Technical Center of Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China）

To establish a method for quantitative analysis of gliadin from wheat in foods by ELlSA.The mouse anti-gliadin McAb was used as a coating antibody in the concentration of 2μg/mL，and a horseradish peroxidaseconjugated anti-gliadin as an enzyme-labeled antibody in the optimal working dilution of 1∶8000，and a series of concentrations of gliadin solution as standards.The contents of gliadin in samples were determined.The optimal linear range was 19.53～5000ng/mL and R2≥0.99.The quantitative limit of detection was 19.53ng/mL，which was corresponding to 7.81ppm in food samples.The recovery rate for the accuracy test was 93.57%～105.72%.The coefficient of variation for precision assay were 3.07%～5.91%in the same test and 0.26%～5.24%among three tests.Cross reaction was only observed with barley.The set of kit could be placed 4℃for two weeks.The method is sensitive，accurate，specific.lt is suitable for quantitative determination of gliadin in foods.

gliadin；ELlSA；quantitative determination

TS207.3

A

1002-0306（2010）11-0360-04

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

秦倩茹（1984-），女，在讀碩士，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

科技部質(zhì)檢公益項(xiàng)目（2007GYJ036）。