不同補(bǔ)料發(fā)酵方式對(duì)重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響

灑榮波，石貴陽(yáng)，唐瑜菁

（1.泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東泰安271016；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214036）

不同補(bǔ)料發(fā)酵方式對(duì)重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響

灑榮波1，石貴陽(yáng)2，唐瑜菁1

（1.泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東泰安271016；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214036）

目的：研究5L發(fā)酵罐中葡萄糖補(bǔ)料方式對(duì)重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。方法：葡萄糖分批發(fā)酵階段結(jié)束以后，以不同的流加策略流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。結(jié)果：分批發(fā)酵初始葡萄糖最佳濃度為10g/L；采用間歇補(bǔ)料和恒速流加補(bǔ)料方式培養(yǎng)畢赤酵母，發(fā)酵結(jié)束后菌體細(xì)胞干重分別為33.2g/L和41.5g/L，而采用指數(shù)流加補(bǔ)料方式，發(fā)酵前期和發(fā)酵后期控制比生長(zhǎng)速率分別為0.20h-1和0.15h-1，發(fā)酵結(jié)束后菌體細(xì)胞干重可達(dá)53.4g/L。結(jié)論：采用分階段控制比生長(zhǎng)速率的發(fā)酵策略，發(fā)酵結(jié)束后菌體細(xì)胞干重遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于間歇補(bǔ)料和恒速流加補(bǔ)料發(fā)酵策略。

重組畢赤酵母，高密度培養(yǎng)，補(bǔ)料方式

甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母是一種具有表達(dá)率高、遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)物可分泌等優(yōu)點(diǎn)的外源分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白表達(dá)的一種優(yōu)秀宿主［1］。它能夠生長(zhǎng)在以甲醇作為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上，擁有一條高效誘導(dǎo)的甲醇利用途徑。目前巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用非常廣泛，到目前為止，已有數(shù)百種外源蛋白在該系統(tǒng)中得到表達(dá)［2］。按照Invitrogen公司對(duì)畢赤酵母的研究，外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)分兩步，即菌體生長(zhǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。先在以甘油或葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，達(dá)到一定OD值后無(wú)菌離心，收集菌體后在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。高密度發(fā)酵是基因工程菌提高外源蛋白表達(dá)水平的一種重要策略，迄今已有許多蛋白通過(guò)高密度發(fā)酵獲得高表達(dá)量［3-4］。畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的累積不會(huì)對(duì)自身產(chǎn)生毒副作用，且畢赤酵母的表達(dá)菌株很容易從搖瓶培養(yǎng)擴(kuò)大到大批量高密度發(fā)酵，不影響外源基因的表達(dá)水平。這兩點(diǎn)注定了畢赤酵母具有可用于高密度發(fā)酵的巨大潛力［5］。筆者選取了一種廉價(jià)的工業(yè)化培養(yǎng)基，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，使得此培養(yǎng)基在最佳培養(yǎng)條件下生產(chǎn)畢赤氏酵母的生物量達(dá)到最大。本文報(bào)道了在5L發(fā)酵罐中以不同補(bǔ)料方式對(duì)重組畢赤酵母高密度發(fā)酵的影響，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

表1 不同葡萄糖初始濃度的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

巴斯德畢赤氏酵母 pichia pastoris KM71（his4 arg4 aox1∷ARG4） 表達(dá)載體pPIC9k為Invitrogen公司產(chǎn)品，外源基因?yàn)榇植诿}孢菌（Neurospora crassa）植酸酶基因，載體呈線性整合在染色體上，由江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題組構(gòu)建；平板保存及活化培養(yǎng)基 YPD固體培養(yǎng)基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH自然）；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖1%，KH2PO40.7%，MgSO4·7H2O 0.03%、FeSO4· 7H2O 0.05%、MnSO4·H2O 0.05%，用25%氨水調(diào)節(jié)pH為5.5；發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基 葡萄糖40%，MgSO4· 7H2O 10g/L；培養(yǎng)基滅菌條件 0.1MPa，121℃下滅菌20min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子活化方法 見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。

1.2.2 種子培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)法 見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。

1.2.3 葡萄糖分批發(fā)酵培養(yǎng)方法 將搖瓶種子按10%接種量接入裝有3L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，通氣量為1.5vvm，在堿液瓶中加入25%（V/V）濃氨水，發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液pH控制在5.5?？諝饬髁繛?.5vvm，轉(zhuǎn)速為800r/min時(shí)，接種前設(shè)定溶氧量（DO）為100%，當(dāng)初始葡萄糖耗盡后開始流加補(bǔ)料液。

1.2.4 葡萄糖流加方法 在葡萄糖分批發(fā)酵階段結(jié)束以后，以不同的流加策略流加補(bǔ)料培養(yǎng)基直到菌體培養(yǎng)至所需密度。在此階段，依舊通過(guò)流加25%氨水保持pH恒定在5.5，調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速使溶氧維持在20%以上。

1.3 分析方法

1.3.1 酵母細(xì)胞密度測(cè)定 見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。

1.3.2 菌體生物量的測(cè)定 見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。

1.3.3 葡萄糖濃度的測(cè)定 DNS法［6］。

1.3.4 pH的測(cè)定 發(fā)酵罐pH電極在線檢測(cè)。

1.3.5 溶氧（DO）的測(cè)定 發(fā)酵罐溶氧電極在線檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 5L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)初始葡萄糖濃度的確定

為了獲得更高的葡萄糖細(xì)胞得率，必須使初始培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度能使培養(yǎng)菌以較快的速度產(chǎn)生菌體，為此進(jìn)行了葡萄糖初始濃度的搖瓶實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖1及表1所示。從中可以看出，隨著葡萄糖濃度的升高，最終細(xì)胞干重（DCW）也隨之增加，但最大細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度及葡萄糖的細(xì)胞得率卻有所不同，葡萄糖濃度為10g/L時(shí)的最大細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度及細(xì)胞平均產(chǎn)率最大，30g/L濃度的葡萄糖最大細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度及細(xì)胞平均產(chǎn)率最低。綜合考慮，我們選擇5L罐分批培養(yǎng)時(shí)的初始葡萄糖濃度為10g/L。

圖1 不同葡萄糖初始濃度與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系

2.2 生長(zhǎng)期碳源葡萄糖補(bǔ)料方式的探索基因工程菌發(fā)酵應(yīng)在保證基因表達(dá)的前提下盡量提高菌體密度，這樣才能提高工作效率以利于后期的分離、純化［7］。在分批培養(yǎng)的生長(zhǎng)期進(jìn)行流加補(bǔ)料可實(shí)現(xiàn)畢赤酵母工程菌的高密度培養(yǎng)，為產(chǎn)酶期提高植酸酶表達(dá)分泌水平奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。我們實(shí)驗(yàn)了生長(zhǎng)期葡萄糖的不同流加方式對(duì)工程菌生長(zhǎng)的影響。

2.2.1 間歇補(bǔ)料發(fā)酵 間歇補(bǔ)料是一種常見(jiàn)的流加發(fā)酵方式，實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)料量70mL/次，64h結(jié)束發(fā)酵，總共補(bǔ)料量為560mL葡萄糖，折合葡萄糖224g，實(shí)驗(yàn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)曲線如圖2所示。從圖中可以看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行，補(bǔ)料開始時(shí)剩余葡萄糖量隨之增多?？紤]到補(bǔ)料量及菌體培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)性，我們選擇在64h時(shí)停止發(fā)酵，最終達(dá)到的酵母細(xì)胞干重為33.2g/L。

圖2 間歇補(bǔ)料發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.2 恒速流加補(bǔ)料發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)中在分批發(fā)酵結(jié)束后，以5mL·L-1·h-1的恒定速率流加補(bǔ)料液，每4h取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛燃熬w密度，56h時(shí)補(bǔ)料結(jié)束，共補(bǔ)料600mL，折合葡萄糖240g。實(shí)驗(yàn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)曲線如圖3所示。從圖中可以看出，補(bǔ)料開始后的24h內(nèi)，菌體密度增加較快，細(xì)胞干重基本上呈線性增加，補(bǔ)入的葡萄糖也全部耗盡，發(fā)酵液中的殘?zhí)腔揪S持在0.2g/L附近；補(bǔ)料24h之后，發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛乳_始增加，隨著補(bǔ)料時(shí)間的延長(zhǎng)，殘?zhí)菨舛仍絹?lái)越高，在56h時(shí)殘?zhí)且迅哌_(dá)2.8g/L，因此此時(shí)停止補(bǔ)料，發(fā)酵結(jié)束，最終細(xì)胞干重可達(dá)41.5g/L。

圖3 恒速補(bǔ)料發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.3 指數(shù)流加發(fā)酵 Yee L［8］認(rèn)為目前最成功的基因工程菌高密度培養(yǎng)的方法是指數(shù)流加法。理想的微生物生長(zhǎng)是菌體量相對(duì)時(shí)間以指數(shù)函數(shù)增加，故可以使流加物料量以時(shí)間的指數(shù)函數(shù)增加。指數(shù)流加進(jìn)料速率與時(shí)間的關(guān)系為

式（1）中，F(xiàn)（t）為t時(shí)刻葡萄糖的流加速率，L·h-1；V0為補(bǔ)料開始時(shí)刻的發(fā)酵液體積，L；X0為補(bǔ)料開始時(shí)的菌體濃度，g·L-1；μset為設(shè)定的比生長(zhǎng)速率，它要滿足的一個(gè)條件是：μset＜μmax；YX/S為菌體對(duì)底物的得率系數(shù)；t是發(fā)酵時(shí)間，h；SF是流加葡萄糖的濃度，g·L-1；S是罐內(nèi)葡萄糖的濃度，g·L-1。實(shí)驗(yàn)中V0=3L，X0=4.1g·L-1，YX/S由分批發(fā)酵數(shù)據(jù)計(jì)算為0.41g·g-1，SF=400g·L-1。通過(guò)流加發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型對(duì)畢赤酵母分批發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，得到菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為：

式（2）中X為菌體濃度，g·L-1，t是發(fā)酵時(shí)間，h。該模型能夠很好地?cái)M合菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的變化趨勢(shì)，回歸的R2值為0.997，結(jié)合菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算求得實(shí)驗(yàn)最大比生長(zhǎng)速率 μmax= 0.385h-1，原則上只要我們所取的μset值小于0.385h-1就可以了，實(shí)驗(yàn)中初步設(shè)定μset=0.15h-1。指數(shù)流加補(bǔ)料的動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示。

圖4 指數(shù)流加補(bǔ)料的動(dòng)力學(xué)曲線（μset=0.15h-1）

從圖中可以看出，指數(shù)流加補(bǔ)料開始之后，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度一直維持在0水平，說(shuō)明加入的葡萄糖被完全消耗，DO值也在發(fā)酵全過(guò)程保持在20%以上，發(fā)酵進(jìn)行到52h時(shí)停止補(bǔ)料，此時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到最高為39.7g/L。由于實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的μset在較低的0.15h-1，補(bǔ)入的葡萄糖很快被酵母利用，畢赤酵母的生長(zhǎng)仍處于葡萄糖限制生長(zhǎng)的狀態(tài)，三羧酸循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力還沒(méi)有達(dá)到飽和狀態(tài)。如果畢赤酵母攝入的底物過(guò)多，比生長(zhǎng)速率大于一定的閾值后很容易積累乙醇，這個(gè)閾值一般在0.14～0.5h-1范圍內(nèi)［11］，因此本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的比生長(zhǎng)速率是較為保守的。

為了確定最佳的比生長(zhǎng)速率，我們又進(jìn)行了一次μset=0.20h-1的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，當(dāng)我們提高了比生長(zhǎng)速率后，葡萄糖的流加速率也相應(yīng)隨之增加，52h結(jié)束發(fā)酵時(shí)，最大細(xì)胞干重為44.1g/L。整個(gè)過(guò)程流加了葡萄糖補(bǔ)料液800mL，但所得到的菌體干重卻僅為μset=0.15h-1時(shí)的1.2倍，沒(méi)有明顯的增加。從圖中的DO曲線可以看出：在發(fā)酵的前36h，發(fā)酵液中的DO值可以保持在20%以上，但36h（此時(shí)已補(bǔ)料20h）以后，DO值持續(xù)下降，40h已下降到12%，48h的DO值已接近為0，說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，需氧較多，單純依靠提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量已不能滿足DO值大于20%，此時(shí)葡萄糖已有一部分進(jìn)入了厭氧發(fā)酵途徑，而沒(méi)有用來(lái)生長(zhǎng)菌體，從而造成了葡萄糖的浪費(fèi)。

圖5 指數(shù)流加補(bǔ)料的動(dòng)力學(xué)曲線（μset=0.20h-1）

為了達(dá)到更高的菌體密度，實(shí)驗(yàn)中我們采取這樣一種補(bǔ)料策略：為了讓酵母生長(zhǎng)更快一些，我們可以采用分階段設(shè)定比生長(zhǎng)速率的方法來(lái)進(jìn)行畢赤酵母的上罐發(fā)酵。在指數(shù)補(bǔ)料階段的前20h，我們可以設(shè)定 μset=0.20h-1；而在 20h以后，設(shè)定 μset= 0.15h-1。這樣可以在補(bǔ)料前期不影響酵母菌體的生長(zhǎng)，而在補(bǔ)料后期又不會(huì)造成酵母生長(zhǎng)過(guò)于旺盛、溶氧太低而進(jìn)行厭氧發(fā)酵。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)如圖所示。

圖6 指數(shù)流加補(bǔ)料的動(dòng)力學(xué)曲線（分階段控制比生長(zhǎng)速率）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目的，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的DO值一直控制在20%以上，補(bǔ)料階段的殘?zhí)菨舛纫惨恢本S持在0水平，最終達(dá)到53.4g/L的菌體密度，比前兩次指數(shù)流加實(shí)驗(yàn)都有所提高。

3 討論

在本文中，我們通過(guò)在指數(shù)流加過(guò)程中分階段設(shè)定不同的比長(zhǎng)速率來(lái)控制葡萄糖的流加速率，使發(fā)酵液中的碳源濃度維持在接近0的水平，可維持較高的溶氧水平，很好地解決了發(fā)酵進(jìn)行到36h時(shí)溶氧水平降為0的矛盾。實(shí)驗(yàn)中由于上罐次數(shù)的限制，僅實(shí)驗(yàn)了比生長(zhǎng)速率分別為0.15h-1和0.20h-1，旨在發(fā)現(xiàn)其中規(guī)律。根據(jù)所建立的動(dòng)力學(xué)模型，提出了分階段控制比生長(zhǎng)速率的方法，發(fā)酵前20h和20h以后控制比生長(zhǎng)速率分別為0.20h-1和0.15h-1，最終菌體細(xì)胞干重達(dá)到53.4g/L，比控制恒定比生長(zhǎng)速率時(shí)的菌體細(xì)胞干重有所提高。

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Influence of different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris

SA Rong-bo1，SHI Gui-yang2，TANG Yu-jing1
（1.Bioscience Department，Taishan Medical University，Taian 271016，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China）

Objcetive：To develop the influence of three different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris.Method：Medium was fed in different feeding strategies after batch fermentation ended.Results：The optimum concentration for glucose was 10g/L in batch fermentation.The dry cell weight were 33.2g/L and 41.5g/L respectively in intermission and constant velocity fed-batch fermentation.When the specific growth rate was controlled 0.20h-1and 0.15h-1prophase and anaphase of the fermentation，the dry cell weight in exponential fed-batch processes was 53.4g/L.Conclusion：The dry cell weight with different specific growth rate was higher than the other two fermentation strategies.

recombinant pichia pastoris；high density culture；feeding strategy

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0210-04

2009-11-04

灑榮波（1978-），男，講師，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵。

泰山醫(yī)學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2008-2009）。