冷凍對甲殼素固體結(jié)構(gòu)的影響

劉廷國，宋 雪，李 斌，*，陸志敏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.池州學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)系，安徽池州247100）

冷凍對甲殼素固體結(jié)構(gòu)的影響

劉廷國1，2，宋 雪1，李 斌1，*，陸志敏2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.池州學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)系，安徽池州247100）

甲殼素和質(zhì)量濃度45%的NaOH溶液按料液比1∶10充分混勻，分別在-18℃和-35℃下冷凍處理，研究堿-冷凍處理對甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。采用酸堿滴定法測定樣品的脫乙酰度，X-射線衍射、紅外光譜和差示掃描量熱分析研究經(jīng)冷凍后樣品聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，慢速冷凍過程中，冰晶的形成和生長能夠破壞分子內(nèi)/分子間氫鍵相互作用，使有序的分子結(jié)構(gòu)紊亂，破壞致密的晶體結(jié)構(gòu)，使甲殼素結(jié)晶度下降。但是這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)的破壞作用是不穩(wěn)定的、可逆的。盡管如此，堿-冷凍處理仍可以作為一種有效的甲殼素化學(xué)修飾前處理手段，能夠明顯加快反應(yīng)速率而不影響甲殼素分子鏈主體結(jié)構(gòu)。

甲殼素，冷凍，非均相，凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)

甲殼素是由2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵縮合而成的線性同聚多糖，主要是由海產(chǎn)品蝦和蟹加工后的廢棄物——蝦頭和蟹殼經(jīng)過稀酸脫鈣和稀堿脫除蛋白質(zhì)后制成的高附加值天然多糖［1］。它是自然界中迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一具有明顯堿性、帶有正電荷、產(chǎn)量僅次于纖維素的天然多糖，也是除蛋白質(zhì)外含氮量最高的可再生天然有機(jī)化合物，估計每年自然界生物合成的甲殼素將近100億t［2-3］。甲殼素及其衍生物具有優(yōu)良的透氣性、成膜性、成纖維性、吸濕性、生物降解性、生物相容性、廣譜抗菌性及重金屬離子螯合性等［4-5］，在紡織、印染、造紙、醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)保、生物工程、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域顯示出其獨(dú)特的應(yīng)用價值，市場發(fā)展前景樂觀［6-7］。但甲殼素不溶于一般溶劑，濃酸雖可使其溶解，但對分子鏈降解嚴(yán)重［8］。分子鏈上存在大量化學(xué)反應(yīng)惰性的乙酰氨基，強(qiáng)化了甲殼素分子致密的晶體結(jié)構(gòu)，增大了對甲殼素直接進(jìn)行化學(xué)修飾的難度。破壞甲殼素結(jié)晶結(jié)構(gòu)、提高溶解性和化學(xué)反應(yīng)活性成為近年科學(xué)家廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)研究問題之一［9-10］?；瘜W(xué)修飾［11］、高能射線輻射［12-13］、超聲波［14］、冷凍［15-16］以及超微粉碎［17］等眾多方法被用來破壞甲殼素致密的晶體結(jié)構(gòu)，提高其溶解性或化學(xué)反應(yīng)活性。其中，冷凍法因其安全、高效、對甲殼素分子鏈主體結(jié)構(gòu)損傷小而被廣泛應(yīng)用?？茖W(xué)家已經(jīng)注意到在冷凍過程中，冰晶體的存在和生長，會不同程度地對碳水化合物高聚物微觀結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷，進(jìn)而破壞其晶體結(jié)構(gòu)［16，18-19］。目前對甲殼素冷凍處理的研究報道較少且不系統(tǒng)，國內(nèi)尚無該方面文獻(xiàn)報道，本研究著重探討了緩慢凍結(jié)和快速凍結(jié)對甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為冷凍法在碳水化合物研究中的擴(kuò)大應(yīng)用積累理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，也為甲殼素的深加工提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素 食品級，脫乙酰度21.11%，粒度60～80目，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水，所用化學(xué)試劑均為分析純。

循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III） 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；冷凍離心機(jī)（TGL-16C） 珠海云天環(huán)保科技有限公司；真空干燥箱（DZF-6050） 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；X-射線衍射儀（D/Max-IIIA）日本Rigaku公司；紅外光譜儀（NEXUS 470 FT-IR）美國Nicolet公司；差示掃描量熱儀（204-F1） 德國Netzsch公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿甲殼素冷凍處理 一定質(zhì)量的甲殼素粉末與質(zhì)量濃度為45%的NaOH溶液按料液比1∶10（W∶V）充分混合均勻，室溫靜置8h后真空脫氣30min，使甲殼素顆粒充分浸潤，密封后分別置于-18℃和-35℃下冷凍1～5d。處理結(jié)束后，樣品取出經(jīng)自然解凍后觀察樣品溶解情況，樣品于4℃、4000r/min離心20min，沉淀用70%（V/V）乙醇洗滌至用0.1mol/L AgNO3檢測無Cl-殘留為止，再分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，60℃真空干燥24h，取出研磨置干燥器備用。

1.2.2 測試方法

1.2.2.1 理化指標(biāo) 溶解性的測定采用目測法，0.20g干燥的甲殼素樣品分散于20mL 0.1mol/L鹽酸溶液中，25℃磁力攪拌4h，觀察樣品溶解情況。樣品脫乙酰度（Degree of Deacetylation，DDA，%）采用改進(jìn)的堿量法測定［20］。

1.2.2.2 結(jié)構(gòu)表征 粉末 X-射線衍射（X-Ray Diffraction，XRD）圖譜由X-射線光譜儀獲得，測定條件為20℃，35kV，30mA，石墨單色器，DS/SS=1°，RS =0.3mm，采用Cu Kα1輻射λ=1.54184?。掃描角度（2Theta，2θ，°）范圍為4～60°，步進(jìn)0.02°，每分鐘4°，結(jié)晶度由（110）晶面的結(jié)晶指數(shù)（Crystallinity Index，CrI110，%）表示，計算公式如下：CrI110=（I110-Iam）× 100/I110（式中I110指2θ為20°左右最強(qiáng)衍射峰的相對強(qiáng)度，Iam指2θ為16°處的無定形漫散射峰的相對強(qiáng)度）［21］，數(shù)據(jù)的分析處理采用MDI Jade軟件包（Jade 5.0，Materials Data Inc，Japan）實(shí)現(xiàn)。

傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）由FT-IR光譜儀在室溫、干燥條件下掃描獲得，掃描范圍為4000～400cm-1，分辨率4cm-1，累加32次，以空氣為背景，每個樣品掃描前扣除背景［20，22］，所有數(shù)據(jù)的采集和處理采用儀器自帶的OMNIC分析軟件包分析獲得。

差示掃描量熱（Differential Scanning Calorimetry，DSC）儀研究樣品熱特性，純金屬銦（99.99%）校正儀器的溫度和熱焓，準(zhǔn)確稱取5.0±0.1mg樣品放入蓋子中心帶孔的鋁坩堝中，密封，用相同的空坩堝作參比，以20℃·min-1升溫速率從30℃升至190℃，恒溫5min?？焖倮鋮s后重新稱重，再以10℃·min-1從30℃加熱到500℃，整個過程均在干燥N2下進(jìn)行，吹掃氣流量20mL·min-1，保護(hù)氣流量60mL·min-1，數(shù)據(jù)的采集和分析利用儀器自帶的Proteus軟件包實(shí)現(xiàn)［23-24］。

2 結(jié)果與討論

表1 -18/-35℃堿冷凍處理對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響

2.1 堿-冷凍處理對甲殼素理化性質(zhì)的影響

甲殼素非均相脫乙酰反應(yīng)可視為典型的液固復(fù)相反應(yīng)，遵循復(fù)相反應(yīng)規(guī)律。探討了甲殼素濃堿混合物經(jīng)不同凍結(jié)溫度冷凍處理后對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響，通過測定樣品的脫乙酰度間接監(jiān)測脫乙酰反應(yīng)進(jìn)程。常規(guī)家用冰箱冷凍室溫度為-18℃，而常規(guī)大型冷庫溫度為-35℃，碳水化合物冷凍加工的已有研究表明，溫度高于-18～-23℃的凍結(jié)屬慢速凍結(jié)，低于-30℃屬快速凍結(jié)，在慢速凍結(jié)過程中，冰結(jié)晶首先出現(xiàn)在樣品顆粒間隙，且分布不均勻，對樣品結(jié)構(gòu)的損傷較大；反之，在快速凍結(jié)過程中，冰結(jié)晶即可均勻地分布在樣品顆粒間隙中并形成小的針狀冰結(jié)晶，對結(jié)構(gòu)的損傷較小。結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際和濃堿溶液的性質(zhì)本研究選擇-18℃和-35℃分別作為冷凍處理溫度。

在兩種不同溫度下冷凍處理的樣品，冷凍結(jié)束后經(jīng)解凍均未觀測到樣品有溶解現(xiàn)象，而文獻(xiàn)［20］報道，采用低溫冷凍-解凍的溫度循環(huán)處理可以使甲殼素溶解于10%NaOH溶液中，從而獲得一種甲殼素均相溶液。經(jīng)堿-冷凍處理的甲殼素樣品分散于一定量0.1mol/L HCl溶液中，攪拌一定時間，亦未觀測到溶解現(xiàn)象，-18℃處理樣品有輕微溶脹現(xiàn)象，而-35℃處理樣品未有明顯溶脹現(xiàn)象發(fā)生。表1反映了堿-冷凍處理對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響。由表可知，經(jīng)過5d的冷凍處理，甲殼素樣品間脫乙酰度無顯著差異，與原料甲殼素相比亦無顯著差異。以上現(xiàn)象說明，冷凍過程中冰晶的形成和生長強(qiáng)制NaOH分子滲透進(jìn)甲殼素顆粒內(nèi)部，打開分子間或分子內(nèi)部分氫鍵相互作用，破壞甲殼素致密的晶體結(jié)構(gòu)，但是對甲殼素分子鏈的破壞較少，能夠較好地保持甲殼素分子結(jié)構(gòu)的完整性，為利用甲殼素為原料進(jìn)行進(jìn)一步化學(xué)修飾提供了可能。

2.2 堿-冷凍處理對甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 XRD分析 圖 1給出了純化甲殼素和經(jīng)-18℃冷凍處理樣品的XRD圖譜。純甲殼素在2θ為9.44、19.28、20.80、23.70和26.40°有5個尖銳的衍射峰，分別對應(yīng)于（020）、（110）、（120）、（101）和（130）晶面，屬正交晶系，符合α-甲殼素的衍射特征。經(jīng)冷凍處理，這5個清晰衍射峰強(qiáng)度明顯減弱或被掩蓋。特別是對應(yīng)于（120）和（101）晶面的衍射峰幾乎完全被掩蓋。由圖可知，冷凍處理1d的樣品19.28°處衍射峰強(qiáng)度急劇下降為甲殼素的35%，隨后下降緩慢，第2d達(dá)到最低值34.62%，隨著處理時間的延長，又開始緩慢回升，冷凍5d樣品衍射峰強(qiáng)度又恢復(fù)到原料甲殼素的59.43%。冷凍處理1d樣品的CrI110由原料的99.15%下降到83.16%，2d樣品CrI110降至最低值為 82.30%，處理 5d后回升至96.05%，說明冷凍2d即可較大限度破壞甲殼素晶體結(jié)構(gòu)，作為甲殼素化學(xué)修飾前處理手段是比較合適的，單純通過增加冷凍處理時間并不能進(jìn)一步破壞甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖1 -18℃冷凍處理樣品的XRD圖譜

值得注意的是，文獻(xiàn)報道（020）晶面衍射峰強(qiáng)度隨脫乙酰度的增加而降低，結(jié)晶度也隨之降低［25］。而從圖1可以看出，與甲殼素相比，該晶面衍射強(qiáng)度確有降低，但在處理達(dá)到2d以后，衍射峰的強(qiáng)度反而上升，不過該晶面的面間距由未處理的9.3685?增大到2d的9.9580?，然后維持在9.7171?左右，這進(jìn)一步證明了冷凍可以降低甲殼素分子結(jié)構(gòu)的規(guī)整性，使其分子間排列松散，結(jié)晶度降低，有利于進(jìn)一步處理。之所以產(chǎn)生與上述文獻(xiàn)的差異，可能是在此脫乙酰度差別不大（表1）的前提下，脫乙酰度變化對結(jié)晶區(qū)的影響，尚不及冷凍產(chǎn)生的影響。

圖2給出了分別在-18℃和-35℃冷凍1、2、5d樣品的XRD圖譜，由圖可見，-35℃處理樣品，在1～5d冷凍中衍射峰強(qiáng)度幾乎無差異。而在-18℃處理1d和2d的樣品，卻比-35℃處理的樣品衍射峰強(qiáng)度明顯低得多，說明-18℃左右的溫度處理最適合破壞甲殼素分子間相互作用力，更低的溫度反而不利于這種作用。其主要原因是-18℃更接近甲殼素堿混合物的凍結(jié)點(diǎn)溫度（不能簡單理解為冰點(diǎn)溫度），在此溫度下，冰晶中小分子的運(yùn)動性顯然強(qiáng)于-35℃下，冰晶的晶粒亦大于后者，因此可以更加有效地破壞甲殼素晶體結(jié)構(gòu)。而-35℃冷凍時，體系完全處于玻璃態(tài)下，分子運(yùn)動性大大減弱，形成的冰晶晶粒細(xì)小、分布均勻，對甲殼素結(jié)構(gòu)的破壞作用比較有限。這實(shí)際上與碳水化合物冷凍加工中的許多現(xiàn)象是吻合的。

圖2 -35℃與-18℃冷凍處理樣品的對比XRD圖譜

-18℃處理更長時間后，已被強(qiáng)制疏松排列的運(yùn)動性較強(qiáng)的甲殼素分子，并不能處于穩(wěn)態(tài)，需要重新進(jìn)行自組裝，比如以熵增的方式，回到低能態(tài)，此時為適應(yīng)新的環(huán)境相態(tài)，部分微晶結(jié)構(gòu)可能稍有差異，但結(jié)晶度提高，圖2處理5d的樣品與-35℃樣品的衍射譜線幾乎重合即說明這一問題。

2.2.2 FT-IR分析 紅外光譜是研究有機(jī)物氫鍵相互作用的一種較為有效的常規(guī)手段之一。圖3和圖4分別給出了冷凍處理溫度為-18℃和-35℃樣品的紅外光譜圖。對比甲殼素的FT-IR光譜圖［20］，對于-18℃冷凍處理樣品，甲殼素3448cm-1處的O-H伸縮振動吸收峰變寬并向低波數(shù)方向移動，處理1d樣品最為明顯，移動了14cm-1，這是典型的分子間氫鍵作用減弱的標(biāo)志，然而，隨處理時間的延長又緩慢恢復(fù)，5d時重新回到3448cm-1，這與XRD分析的結(jié)果是一致的。

圖3 -18℃冷凍處理樣品的FT-IR圖譜

圖4 -35℃冷凍處理樣品的FT-IR圖譜

-35℃處理樣品在該O-H伸縮振動及氫鍵作用區(qū)域，變化明顯不及-18℃處理樣品，除了4d樣品向低波數(shù)方向移動了17cm-1外，其它樣品偏移量很小，僅1～7、3274、3103cm-1處分別反映N-H伸縮振動的吸收峰和C（21）NH…O=C（73）和C（61）OH…HOC（62）分子內(nèi)氫鍵［20］，與原料甲殼素相比均明顯減弱，-18℃和-35℃樣品差別并不顯著，這亦與XRD分析結(jié)果相吻合。

2.2.3 DSC分析 對原料與樣品進(jìn)行差示掃描量熱分析，從熱力學(xué)角度分析處理前后甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)的差異，-18℃和-35℃處理樣品DSC圖譜和一階微分DSC圖譜與甲殼素和殼聚糖原樣相比明顯不同，所有樣品的熱分解參數(shù)列于表2中。經(jīng)過冷凍處理的所有樣品DSC圖譜，觀測到兩個明顯的熱行為，第一個是分別以293.2℃和296.0℃為中心的放熱峰，歸因于甲殼素分子的重結(jié)晶；第二個是分別以343.3℃和337.6℃為中心的吸熱峰，歸因于甲殼素的熱分解，這與甲殼素原粉的熱特性極為相似，但分解溫度提前了50℃左右。說明經(jīng)過堿-冷凍處理使甲殼素致密的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞或減弱，導(dǎo)致分子柔性增加，分子運(yùn)動性、擴(kuò)散性增強(qiáng)，穩(wěn)定性變差，分解溫度提前。

表2 -18/-35℃堿冷凍處理對甲殼素?zé)岱治鎏匦缘挠绊?/p>

文獻(xiàn)報道甲殼素和殼聚糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Glass Transition Temperature，Tg）分別為236℃［26］和203℃［27］。從表2數(shù)據(jù)可以看出，樣品經(jīng)過冷凍處理后玻璃化轉(zhuǎn)變溫度急劇降低，這也有力地說明了樣品經(jīng)過冷凍處理后，分子的運(yùn)動性大大提高。然而各組樣品自身之間Tg變化并不顯著，特別是經(jīng)過-35℃處理樣品的Tg降低的更多，但重結(jié)晶峰溫度變化卻不及-18℃處理樣品劇烈，說明-35℃處理的樣品比-18℃處理樣品處于更不穩(wěn)定的亞穩(wěn)態(tài)，這與XRD、FT-IR的分析結(jié)果相吻合。

綜上所述，冷凍處理樣品的熱特性顯然不同于甲殼素，重結(jié)晶峰的出現(xiàn)，說明經(jīng)冷凍誘導(dǎo)的甲殼素結(jié)晶破壞作用并不是十分徹底，而且這種破壞作用是可逆的，經(jīng)過加熱后又可以重新形成結(jié)晶。然而，即使如此，冷凍處理還是可以顯著降低甲殼素分子致密的晶體結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性降低、分解溫度提前。

3 結(jié)論

探討了堿液冷凍處理對甲殼素凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，冷凍處理過程中形成的冰晶能夠顯著破壞甲殼素分子內(nèi)、分子間氫鍵相互作用，破壞甲殼素高度規(guī)整的分子結(jié)構(gòu)，使其結(jié)晶度下降，有利于進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾。慢速冷凍過程較快速冷凍的破壞作用更為顯著，兩者均能迫使甲殼素分子由穩(wěn)態(tài)趨向于亞穩(wěn)態(tài)。結(jié)構(gòu)分析及理化分析結(jié)果表明，冷凍處理只破壞甲殼素結(jié)晶結(jié)構(gòu)，對分子鏈骨架結(jié)構(gòu)不造成損傷，有利于保持甲殼素固有的生物活性。冷凍導(dǎo)致結(jié)晶度降低的程度有限，最初2d處理時迅速下降，其后逐漸回升，且這種由冷凍誘導(dǎo)的結(jié)晶破壞作用部分可逆，經(jīng)過加熱處理后又會重新形成分子間氫鍵，產(chǎn)生新的微晶，使結(jié)晶度提高。但可以肯定的是，冷凍處理可以作為一種有效、可控的甲殼素化學(xué)修飾前處理手段，以提高反應(yīng)活性。

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Effect of alkali-freezing treatment on the solid state structure of chitin

LIU Ting-guo1，2，SONG Xue1，LI Bin1，*，LU Zhi-min2
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China）

The effects of alkali-freezing treatment on the condensed state structure of chitin were explored.Chitin powder was soaked in concentrated sodium hydroxide（with a mass concentration of 45%，and the ratio of chitin and NaOH solution was 1∶10，W/V）and freezed at-18℃ and-35℃ for further modification.The degree of deacetylation（DDA）was determined by acid-base titration method.X-ray diffraction（XRD），infrared spectroscopy（lR）and differential scanning calorimetry（DSC）measurements were employed to investigate the condensed state structural changes of the freezing-treated chitin powders.Structural analysis results showed that the formation and growth of ice crystal during the slowly freezing process that can break the intra-and/or inter-molecular hydrogen bonds interaction，disorder the ordered molecular structure and destruct the compact crystal structure and decline the crystallinity of chitin.The study explained that the alkali-freezing treatment was beneficial for further modification of chitin，which can increase the chemical reaction rate and keep the main molecular chain structure of chitin completely.

chitin；freezing；heterogeneous；condensed state structure

TS254.9

A

1002-0306（2010）11-0094-05

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

劉廷國（1982-），男，碩士，講師，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品深加工與應(yīng)用。

國家“863”資助項(xiàng)目（2007AA10Z310）；池州學(xué)院化學(xué)材料與工程省級實(shí)驗(yàn)中心建設(shè)項(xiàng)目。