馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)基的篩選及影響因素分析

蔣瑜，張麗芳，朱維賢，李珂

（昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明，650213）

馬鈴薯是世界四大作物之一，由于馬鈴薯具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)成分全和產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)等特點(diǎn)，受到全世界的重視。但馬鈴薯在種植過(guò)程中容易通過(guò)昆蟲(chóng)媒介、摩擦接觸感染病毒，馬鈴薯主要又是以塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，這樣病毒為害逐年加重，使馬鈴薯種薯退化，產(chǎn)量下降。馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)是解決馬鈴薯退化的最有效的方法，它是根據(jù)病毒在植株體內(nèi)分布不均勻性即越靠近新生組織部位（如莖尖和根尖頂端生長(zhǎng)點(diǎn)、新生芽的生長(zhǎng)錐等處）病毒含量越少的原理，結(jié)合使用鈍化病毒的熱處理方法，通過(guò)剝?nèi)∏o尖分生組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得脫毒植株。本文研究了添加不同激素的培養(yǎng)基和莖尖大小對(duì)馬鈴薯莖尖成活及脫毒效果的影響，以期得到合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)出脫毒效果較好的核心苗。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由國(guó)際馬鈴薯中心提供的編號(hào)為B13-6未脫毒的種薯在昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院繁殖的無(wú)菌馬鈴薯組培苗莖尖為試材。

無(wú)菌馬鈴薯組培苗啟動(dòng)培養(yǎng)基配方：MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+肌醇100 mg/L。莖尖培養(yǎng)基配方：①M(fèi)S+GA30.2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；②MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；③MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；④ MS+GA30.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L；⑤MS+GA30.1 mg/L+KT 0.04 mg/L；⑥MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+泛酸鈣 0.2 mg/L+肌醇100 mg/L。以上培養(yǎng)基均添加食用白糖30 g/L，瓊脂 6 g/L，pH 值為 5.8。

1.2 培養(yǎng)條件

溫度：25～30℃，光照：2 000～3 000 lx，光照時(shí)間：10～12 h/d。

1.3 無(wú)菌馬鈴薯組培苗的獲得

將B13-6的薯塊洗凈進(jìn)行打破休眠和催芽處理，當(dāng)薯塊頂芽生長(zhǎng)至1～2 cm后，放入37℃的恒溫箱中進(jìn)行30 d的熱處理，拿出將芽采下用自來(lái)水沖洗干凈，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水漂洗2～3次后，用0.1%的升汞消毒12～15 min，最后用無(wú)菌水漂洗4～5次，用消毒好的解剖刀切去芽的底部放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d左右后可長(zhǎng)出苗，用長(zhǎng)出的苗進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，得到無(wú)菌馬鈴薯組培苗，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.4 培養(yǎng)方法

在接種室內(nèi)的超凈工作臺(tái)上，把已繁殖好的無(wú)菌馬鈴薯組培苗莖尖放在解剖鏡下，用已經(jīng)消毒好的解剖針一層一層地剝離葉片，直到最后暴露出圓滑生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)，用另一根消毒好的解剖針小心切取0.2～0.5 mm大小帶1～2個(gè)葉原基的莖尖，然后將其分別接種于1，2，3，4，5，6 號(hào)培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

將馬鈴薯莖尖接種于6種不同培養(yǎng)基上，且所切莖尖大小不同，從表1可看出，幾種培養(yǎng)基中6號(hào)培養(yǎng)基可直接成苗不形成愈傷組織，是較適宜的培養(yǎng)基；其次是5號(hào)培養(yǎng)基，但要先形成愈傷組織，后長(zhǎng)成苗，且苗少；4號(hào)培養(yǎng)基也要先形成愈傷組織，后長(zhǎng)成苗，且苗較少；其余的培養(yǎng)基不能成苗，不適宜莖尖脫毒培養(yǎng)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖生長(zhǎng)的影響

表2 剝離大小對(duì)莖尖生長(zhǎng)的影響及脫毒效果

從表2可看出，帶1個(gè)葉原基莖尖的脫毒效果較好，但培養(yǎng)天數(shù)長(zhǎng)，成苗困難；而帶2個(gè)葉原基的脫毒效果不好，但培養(yǎng)天數(shù)短，成苗容易一些。

3 小結(jié)與討論

3.1 材料的選取

試驗(yàn)表明同一個(gè)品種個(gè)體之間在病毒感染程度上有很大的差異，所以進(jìn)行莖尖分生組織培養(yǎng)之前，所選的材料必須是表現(xiàn)典型的本品種特性的植株，且植株生長(zhǎng)健壯，無(wú)明顯的病毒性、真菌性、細(xì)菌性病害癥狀，單株產(chǎn)量和大薯率高，收獲后要選擇符合品種特性的薯塊作為外植體繁殖無(wú)菌馬鈴薯組培苗，以提高脫毒效果。由于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒?。≒STV）在目前用植物莖尖分生組織方法很難脫掉，在進(jìn)行莖尖剝離脫毒前，應(yīng)先對(duì)入選的塊莖進(jìn)行PSTV檢測(cè)，淘汰帶有PSTV的薯塊。

本試驗(yàn)是利用無(wú)菌馬鈴薯組培苗進(jìn)行莖尖脫毒，而不是用薯塊所發(fā)芽尖消毒后直接剝離。通過(guò)試驗(yàn)可看出用無(wú)菌馬鈴薯組培苗進(jìn)行莖尖脫毒更易操作，且污染小，可用的莖尖量大，容易得到脫毒苗。

3.2 培養(yǎng)基的配比

通過(guò)本試驗(yàn)可看出，培養(yǎng)基中所加激素的種類及多少對(duì)培養(yǎng)效果有很大的影響。在本試驗(yàn)中最適合的培養(yǎng)基是6號(hào)，其次是5號(hào)培養(yǎng)基，而用6號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)可直接成苗，用5號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)要先產(chǎn)生愈傷組織，然后才長(zhǎng)成苗，而脫毒苗如果通過(guò)愈傷組織這一過(guò)程容易產(chǎn)生變異，所以最適合的培養(yǎng)基是6號(hào)，但6號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)效果也不是太理想，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)，以便找到更適合的培養(yǎng)基。

通過(guò)本試驗(yàn)還可看出，培養(yǎng)基中使用食用白糖也可培養(yǎng)出苗，可代替蔗糖，以減少培養(yǎng)成本。

3.3 對(duì)薯塊的處理

薯塊是在地下，所以表面較臟，如果直接用其萌發(fā)的芽繁殖苗容易污染，而將薯塊洗凈后發(fā)芽繁殖無(wú)菌苗可降低污染率，得到更多的無(wú)菌苗。脫毒材料在進(jìn)行莖尖組織剝?nèi)∏埃瑧?yīng)進(jìn)行材料的熱處理，以鈍化病毒的活性，消除馬鈴薯卷葉病毒，提高脫毒效果。把入選的馬鈴薯塊莖進(jìn)行打破休眠和催芽處理，當(dāng)薯塊頂芽生長(zhǎng)至1～2 cm后，轉(zhuǎn)入恒溫箱內(nèi)進(jìn)行37℃的高溫處理6～8周。通過(guò)對(duì)薯塊進(jìn)行熱處理可提高脫毒效果。

3.4 切取莖尖應(yīng)注意的事項(xiàng)及莖尖的大小

切取莖尖時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①剝離葉片時(shí)用一根解剖針，當(dāng)暴露出圓滑生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)再使用另一根解剖針切，這樣可以減少葉片上所帶的病毒感染生長(zhǎng)點(diǎn)的幾率；②切取生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)應(yīng)少帶一些莖稈組織部分，因?yàn)榍o桿組織中帶有大量的病毒，這樣會(huì)降低脫毒率；③切取生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)不要損傷到生長(zhǎng)點(diǎn)，如果生長(zhǎng)點(diǎn)受損就不可能長(zhǎng)成苗。

莖尖的大小直接影響成苗的時(shí)間、成苗率及脫毒效果。莖尖越小其培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，成苗率也越低；莖尖越大，其培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短，成苗率也相對(duì)較高；而最后的脫毒效果是莖尖越小脫毒的成功率越高。要綜合考慮這2個(gè)因素。

3.5 病毒檢測(cè)

由莖尖分生組織培養(yǎng)獲得的小苗，經(jīng)第1次擴(kuò)繁后要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的病毒檢測(cè)，以確定材料的脫毒情況。一般采用指示植物鑒定法、電鏡檢測(cè)法或抗血清鑒定法，經(jīng)病毒檢測(cè)后，確認(rèn)是不帶病毒的株系，才能進(jìn)一步利用，對(duì)帶病毒的株系應(yīng)淘汰或進(jìn)行再次脫毒。

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