芡實(shí)黃酮類物質(zhì)的提取及抗氧化性研究

李成良 ，陳學(xué)好 ，李良俊 ，張奉民 ，齊斌 ，錢建亞

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225009；2.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院；3.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心；4.常熟理工學(xué)院食品與生物工程學(xué)院）

芡實(shí)（Euryale feroxSalisb），睡蓮科芡屬，一年生大型水生草本植物，原產(chǎn)中國(guó)和東南亞，廣泛生長(zhǎng)于我國(guó)南方湖泊、池塘和灘地，是一種新興的特種水生植物[1，2]。

芡實(shí)主要以種仁（通稱芡米）供食用，其營(yíng)養(yǎng)成分以淀粉為主，另含有蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷、鐵、硫胺素、核黃素、尼克酸、抗壞血酸、黃酮、氨基酸和葡糖基甾醇類化合物等[3,4]。芡實(shí)不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有養(yǎng)血安神、益腎固精、去濕健脾、止瀉止帶等藥用功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將芡實(shí)列為上品，記有“主治濕痹，腰脊酸痛，補(bǔ)中除暴疾，益精氣，強(qiáng)志，令耳目聰明，久服輕身不饑”。芡實(shí)味甘性平，入脾、腎、胃經(jīng)，既能益腎，又能健脾，先天、后天之本皆齊備，能提高人體的免疫力，從而祛病強(qiáng)身，延年益壽，是平補(bǔ)之佳品[5,6]。對(duì)芡實(shí)保健功效和藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)由來(lái)已久，但對(duì)其起作用的成分和機(jī)理的說(shuō)明鮮見(jiàn)報(bào)道。本文以紫花蘇芡和紫花刺芡種仁為原料，研究黃酮類物質(zhì)的提取條件及提取物的抗氧化性質(zhì)，以期為芡實(shí)的科學(xué)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗(yàn)基地種植的“紫花蘇芡”和“紫花刺芡”的成熟種仁。主要試劑蘆丁、DPPH為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

①水分測(cè)定 根據(jù)GB/T 12087-2008淀粉水分測(cè)定法進(jìn)行。

②芡實(shí)總黃酮含量測(cè)定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[7～9]測(cè)定總黃酮含量。將去殼的芡實(shí)種子粉碎過(guò)孔徑1 mm篩。取2 g粉，加入80 mL 95%（V/V，下同）乙醇，80℃水浴加熱回流3 h，抽濾，所得濾液用95%乙醇定容至100 mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以蘆丁含量表示。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

③直接加熱浸提法 a.料液比對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成5組并標(biāo)記，分別稱取5.0 g芡實(shí)粉于 250 mL 錐形瓶中，加入 25，50，75，100，125 mL 95%乙醇，60℃浸泡2 h，過(guò)濾，清洗，然后用 95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

b.溫度對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成五組并標(biāo)記，分別稱取5.0 g芡實(shí)粉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，分別于50℃，60℃，70℃，80℃和90℃保溫2 h，過(guò)濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

c.浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成5組并標(biāo)記，分別稱取5.0 g芡實(shí)粉于250 mL錐形瓶中，加入 50 mL 95%乙醇，60℃浸泡 1，2，3，4，5 h，過(guò)濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

④黃酮超聲波輔助浸提法 a.料液比對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成五組并標(biāo)記，分別稱取5.00 g芡實(shí)于250 mL錐形瓶中，再向其中加入5，25，50，75，100 mL 95%乙醇，用 400 W 超聲波處理 10 min，過(guò)濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

b.超聲波功率對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成5組并標(biāo)記，分別稱取5.00 g芡實(shí)于250 mL錐形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分別用200，300，400，500，600 W 超聲波處理 10 min，過(guò)濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率[10～13]。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

c.超聲波處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響。取15個(gè)錐形瓶，分成五組并標(biāo)記，分別稱取5.00 g芡實(shí)于250 mL錐形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分別在400 W 超聲波處理 5，10，15，20，25 min，過(guò)濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測(cè)220 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

⑤超聲波輔助提取條件優(yōu)化 根據(jù)提取時(shí)間、料液比和超聲功率3個(gè)因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行提取條件優(yōu)化。

⑥芡實(shí)黃酮提取液抗氧化性研究 a.清除DPPH能力的測(cè)定。對(duì)不同黃酮含量的受試物進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定，根據(jù)體系達(dá)到穩(wěn)定時(shí)殘留的DPPH百分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮（以蘆丁為代表）與DPPH摩爾比作圖，得到自由基的清除能力（EC50），定義為使起始DPPH濃度降低50% 所需黃酮的量，其倒數(shù)（1/EC50）為抗自由基能力（ARP）。使用 A-300 EPR 波譜儀（Bruker,德國(guó)），諧振腔為HSC（ER 4119），頻率為X波段。將不同摩爾比的DPPH和提取物加入50 μL硼制毛細(xì)管，在諧振腔中用硅制吊環(huán)固定毛細(xì)管。操作溫度為20℃。5 min起，每間隔5 min記錄一次信號(hào)。DPPH的電子順磁波譜圖是五重峰，利用絕對(duì)值較大的第2個(gè)波峰為計(jì)算依據(jù)，以加入受試物前后波峰信號(hào)大小的比值衡量DPPH的清除能力[14,15]。

表1 超聲輔助黃酮提取因素及水平

b.對(duì)羥自由基的清除作用。樣品組試管中加入1 mL 2 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L 水 楊 酸 、1.2 mL不同濃度的芡實(shí)提取溶液、1 mL 6 mmol/L H2O2或1.2 mL蒸餾水，37℃恒溫水浴保溫一定時(shí)間后，取出冷卻，測(cè)定OD50，根據(jù)以下公式計(jì)算·OH的清除率[16,17]。

清除率（%）=1-（A1-A2）/A0

其中：A0為不含樣品時(shí)的吸光值

A1為含有樣品的吸光值

A2為含有樣品，但不含水楊酸和H2O2的吸光值

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實(shí)種仁中的黃酮類物質(zhì)和水分含量

紫花蘇芡的黃酮類物質(zhì)含量為（1.864±0.029） mg/g，水分為（92.3±3.5）g/kg；紫花刺芡的黃酮類物質(zhì)含量為（1.735±0.005） mg/g，水分為（77.3±1.7） g/kg。

2.2 芡實(shí)黃酮類物質(zhì)的特征光譜

在200～780 nm的范圍內(nèi)，芡實(shí)提取液的最大吸收峰出現(xiàn)在219.9 nm處（圖1，因可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收，圖中只標(biāo)示出紫外光區(qū)部分吸收光譜），這是黃酮物質(zhì)常見(jiàn)的光吸收特征。

2.3 芡實(shí)種仁黃酮類物質(zhì)加熱浸提效果

①料液比的影響 在其他條件一定的情況下，隨著料液比增加，芡實(shí)中黃酮的提取率增加（圖2）。在料液比為 1∶25（m/V）時(shí)，黃酮提取率最大，為 85.92%。

②提取溫度的影響 在其他條件一定的情況下，隨著溫度增加，黃酮的提取率呈增加趨勢(shì)（圖3），在80℃時(shí)獲得了最大提取率，提取率為82.29%。

表2 超聲輔助黃酮提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

③提取時(shí)間的影響 在其他條件一定的情況下，隨著提取時(shí)間增加，黃酮提取率總體呈上升趨勢(shì)（圖4），在4 h時(shí)獲得最大提取率83.43%。

圖5 料液比對(duì)提取效果的影響

圖6 時(shí)間對(duì)提取效果的影響

圖7 超聲功率對(duì)提取效果的影響

2.4 芡實(shí)黃酮超聲波輔助浸提效果

①料液比的影響 與上述純粹的加熱提取比較，超聲輔助提取時(shí)，隨著料液比增加，黃酮的提取率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在料液比為1∶25（m/V）時(shí)獲得最大提取率88.86%（圖5）。

②提取時(shí)間的影響 很明顯，超聲輔助提取可大大縮短提取時(shí)間，在20 min時(shí)獲得最大提取率87.87%（圖6）。

③超聲功率的影響 在其他條件一定的情況下，超聲功率對(duì)黃酮的提取有較大影響，在500 W時(shí)獲得最大提取率（85.21%）（圖7）。

2.5 超聲波輔助浸提法的條件優(yōu)化

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、料液比和超聲功率3個(gè)因素，根據(jù)表1的試驗(yàn)方案，對(duì)所得結(jié)果（表2）進(jìn)行方差分析，結(jié)果（未列出）表明各因素對(duì)芡實(shí)中黃酮提取效果的影響依次為：提取時(shí)間 ＞料液比 ＞超聲功率，單個(gè)因素之間沒(méi)有顯著差異。最佳提取工藝為：提取時(shí)間20 min，功率：400 W，料液比：1∶20（m/v）。

2.6 芡實(shí)黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用

①清除DPPH的能力 以DPPH自由基剩余率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮清除DPPH自由基動(dòng)力學(xué)（圖8），結(jié)果表明芡實(shí)類黃酮屬于慢反應(yīng)動(dòng)力學(xué)類型[18]。由圖9可見(jiàn)，芡實(shí)清除DPPH的能力與紫花刺芡相當(dāng)，其EC50都約為0.075，故其 ARP 為 13.3。

②清除羥自由基的能力以羥自由基為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮清除-OH自由基動(dòng)力學(xué)（圖10）。圖11可以看出，紫花蘇芡對(duì)羥自由基的抑制能力明顯好于紫花刺芡，其半抑制濃度 IC50約為 9.4 mg/L。

3 討論

采用這2種提取方法的黃酮提取率沒(méi)有顯著差異，直接提取方法過(guò)程控制簡(jiǎn)單，容易實(shí)施，但時(shí)間和溶劑的消耗較多。超聲輔助提取是越來(lái)越多使用的方法，省時(shí)快捷，但是否會(huì)破壞有效成分尚不清楚，工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模會(huì)受到設(shè)備大小制約。

圖8 類黃酮清除DPPH動(dòng)力學(xué)

圖9 芡實(shí)提取液的EC50

DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基。通過(guò)檢測(cè)某物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力可以評(píng)價(jià)其抗氧化性的強(qiáng)弱。羥自由基是氧化性極強(qiáng)的氧化劑，其化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，是對(duì)機(jī)體為害最大的自由基，可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，尤其對(duì)脂過(guò)氧化的作用最強(qiáng)，不僅是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的主要原因，而且還一直被認(rèn)為是引起DNA損傷的重要因素。紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮提取物都具有清除DPPH和羥自由基的能力，但效果有差別。從DPPH的清除效果看，芡實(shí)黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化功能。體外抗氧化試驗(yàn)有多種體系，其結(jié)果有不同的含義，要綜合評(píng)價(jià)某種物質(zhì)的抗氧化性能需經(jīng)多種體系驗(yàn)證。此外，本文得到的是混合物，進(jìn)一步的工作可以對(duì)提取物進(jìn)行分離，研究黃酮類化合物的組成和結(jié)構(gòu)，從而弄清差別產(chǎn)生的原因。

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