包埋法共固定化糖化酶與酵母的研究

安玉紅，闞建全，*，任廷遠(yuǎn)，閆躍文

（1.西南大學(xué)食品學(xué)院，重慶400716；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山西太谷030801）

包埋法共固定化糖化酶與酵母的研究

安玉紅1，闞建全1，*，任廷遠(yuǎn)1，閆躍文2

（1.西南大學(xué)食品學(xué)院，重慶400716；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山西太谷030801）

考察了以聚乙烯醇為包埋材料，采用吸附法共固定化糖化酶和酵母菌在釀酒中的應(yīng)用。確定了固化劑的最優(yōu)組合為：硼酸濃度4%、殼聚糖濃度1.0%、氯化鋇濃度為2%、pH為5.0；共固定化糖化酶與酵母的最佳工藝條件為：加酶量60mg/mL，酵母添加量0.01g/mL，PVA濃度為8%。該共固定化顆粒的最佳發(fā)酵條件是：底物濃度20%、發(fā)酵溫度32℃，此條件下發(fā)酵酒度達(dá)11%（V/V）。

聚乙烯醇，共固定化，包埋法

近年來，固定化技術(shù)的應(yīng)用和研究日益廣泛，對固定化細(xì)胞和固定化酶的發(fā)酵機(jī)理的研究也逐步深入。多種微生物、多種酶及酶與微生物的共固定化發(fā)酵體系也正陸續(xù)在生產(chǎn)中得到了應(yīng)用。共固定化是將不同的酶與酶、細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與酶同時固定與統(tǒng)一在體內(nèi)形成共固定化系統(tǒng)的一種技術(shù)，綜合了混合發(fā)酵和固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。這種系統(tǒng)穩(wěn)定，可將幾種不同功能的酶、細(xì)胞和細(xì)胞器在同一體系內(nèi)進(jìn)行協(xié)同作用。固定化技術(shù)是微生物發(fā)酵的有效手段，固定化微生物具有可進(jìn)行高密度增殖培養(yǎng)，提高反應(yīng)器單位體積的生物轉(zhuǎn)化率，延長發(fā)酵細(xì)胞壽命，發(fā)酵周期短，可以反復(fù)利用，穩(wěn)定性增加，利于產(chǎn)物分離等優(yōu)點(diǎn)。固定化酶具有固定化微生物的絕大部分優(yōu)點(diǎn)，同時與游離酶相比具有更優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，所以成為廣泛研究的重點(diǎn)課題。共固定化后的顆?？梢曰厥眨磸?fù)利用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化大規(guī)模生產(chǎn)。根據(jù)需要制成不同的形狀，可以縮小反應(yīng)器的體積，節(jié)省費(fèi)用，減少反應(yīng)器占地面積，提高產(chǎn)量，節(jié)省勞動力，充分利用資源等優(yōu)點(diǎn)，固定化酶或細(xì)胞在生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域必將會不斷擴(kuò)大［1］。本文考察了用包埋法共固定化糖化酶制劑與釀酒酵母細(xì)胞生料發(fā)酵工藝的各種因素，確定了酵母菌與糖化酶共固定化顆粒的最佳工藝技術(shù)條件，以及該顆粒的一些性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

活性干酵母、糖化酶（50000u/g） 無錫杰能科生物工程有限公司；聚乙烯醇（PVA） 天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；殼聚糖 上海伯奧生物科技有限公司；硼酸、無水氯化鋇 天津市光復(fù)科技有限發(fā)展公司；冰醋酸 天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；高粱粉 市售食用級；實(shí)驗(yàn)試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固化劑的配制 稱取一定量的殼聚糖于1%醋酸溶液中保溫溶解，隨即加入所需硼酸和氯化鋇一并保溫溶解，備用。

1.2.2 酶液的制備 稱取一定量的糖化酶酶粉，加少量pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，并用玻璃棒反復(fù)搗研不溶物，將上清液倒入容量瓶中，殘?jiān)儆镁彌_液沖洗，如此反復(fù)3～4次，最后全部倒入容量瓶，用緩沖溶液定容，搖勻，經(jīng)3000～4000r/min的離心機(jī)離心后取上清液，備用。

1.2.3 酵母液的制備 稱取一定量的活性干酵母于2%葡萄糖溶液中，在38℃條件下活化30min，備用。

1.2.4 糖化酶與酵母菌細(xì)胞共固定化 稱取一定量的聚乙烯醇和海藻酸鈉，加入20mL去離子水，浸泡過夜。經(jīng)高壓滅菌溶解后，趁熱攪拌均勻，靜置冷卻備用。制備小球時，將該混合液在所需溫度保溫，將糖化酶液與酵母液一并加入混勻，用注射器吸取該混合液滴入含氯化鈣和硼酸的固化液中，制成直徑為3mm左右的固定化凝膠顆粒，固化一段時間后，濾出固定化凝膠顆粒，用去離子水洗滌三次，浸入無菌水中備用［2］。

1.2.5 固定化酵母細(xì)胞的增殖與發(fā)酵 將固定化酵母細(xì)胞凝膠顆粒用無菌水浸洗5次，加入同體積的由一定濃度的高粱粉水溶液組成的固定化酵母活化增殖培養(yǎng)基。于恒溫?fù)u床上通氣振蕩培養(yǎng)24h后，密閉發(fā)酵。

1.2.6 酒精度的測定 將三角瓶中的發(fā)酵成熟醪過濾后，將濾液置于500mL蒸餾瓶中，量取100mL的蒸餾水，清洗三角瓶，將清洗液倒入蒸餾燒瓶中，裝上冷凝管，用100mL的量筒作接收器，收集餾出液80mL，控制酒溫度20℃，用酒精計(jì)直接讀數(shù)［3］。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合固化劑最佳水平的確定

酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，對熱、酸、堿的抵抗性差，而酵母活細(xì)胞對環(huán)境變化的抗性較強(qiáng)，因此在篩選固化液最佳條件時，以最大限度地保留糖化酶活力為目的，即以酶活力作為比較的指標(biāo)，經(jīng)單因素水平實(shí)驗(yàn)確定硼酸濃度、氯化鋇濃度、pH、殼聚糖濃度對酒度的影響較大，因此將它們定為正交實(shí)驗(yàn)的四因素，取各因素的最佳水平為其中一水平，另三水平用等差法確定，做四因素四水平正交實(shí)驗(yàn)，各因素水平如表1。

表1 固化液正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表

結(jié)合表1、表2，從直觀分析有：RA＞RC＞RD＞RB＞RE，可見各因素對實(shí)驗(yàn)有影響且A、C為主要因素，按照各因素的最好水平選取A3C3D3，即硼酸濃度為4%，pH為5.0，殼聚糖濃度為1.0%，而氯化鋇濃度為次要因素，選取小球成型好的2%即可。即最優(yōu)組合為：硼酸濃度為4%，殼聚糖濃度為1.0%，pH為5.0，氯化鋇濃度為2%。

表2 固化液正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 共固定化最佳水平的確定

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，做加酶量、酵母添加量、載體濃度的正交實(shí)驗(yàn)，采用設(shè)計(jì)固化劑正交實(shí)驗(yàn)的方法，得出其最佳組合，其因素水平表如表3所示。

表3 因素水平表

表4 共固定化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

方差分析的結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出：B、C為主要因素，A為次要因素。對B、C因素用LSR法進(jìn)行多重比較，比較表如表6～表8所示。

表5 方差分析表

表6 多重比較用SSR及LSR值

表7 B因素各水平均值多重比較表

表8 C因素各水平均值多重比較表

多重比較結(jié)果以A3B1C2最好，即最優(yōu)組合為：加酶量120mg，載體 PVA濃度為8%，酵母添加量為0.2g。

2.3 對固定化顆粒的研究

2.3.1 最適底物濃度的確定 分別取高粱粉的濃度為10%、15%、20%、25%、30%，配制200mL的固定化酵母活化增殖培養(yǎng)基，接入制備好的固定化顆粒進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察其對酒度的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，最適宜的底物濃度為20%，隨著底物濃度的增大，酒度先增大后又下降。其原因可能是：當(dāng)?shù)矸蹪舛鹊蜁r，酶與淀粉不能充分接觸并分解為酵母所需的葡萄糖，導(dǎo)致酵母的發(fā)酵能力下降，而采用較高濃度的底物濃度，會使底物在被利用完之前，酒度就已經(jīng)很高，從而抑制了發(fā)酵進(jìn)程。

圖1 底物濃度對酒度的影響

2.3.2 最適發(fā)酵溫度的確定 將制備好的固定化顆粒加入含高粱粉20%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，采取不同溫度：28、30、32、34、36、38℃，進(jìn)行酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察發(fā)酵溫度對酒度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵溫度對酒度的影響

由圖2可知，低溫、高溫都不利于酒度的增加，該固定化顆粒的最適發(fā)酵溫度為32℃。提高溫度能使糖化酶的活力有所增大，但不利于酵母發(fā)酵產(chǎn)酒，而且高溫會導(dǎo)致酵母過早的衰老，被污染的可能性增大。

3 結(jié)論

固化劑的最優(yōu)組合為：硼酸濃度為4%，pH為5.0，殼聚糖濃度為1.0%，氯化鋇濃度為2%；當(dāng)固化劑的總體積為20mL時，共固定化的最佳組合為：加酶量120mg，添加酵母量0.2g，載體濃度為8%。

［1］何國慶.食品發(fā)酵與釀造工藝學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：8-10.

［2］李魁.酵母菌與糖化酶共固定化木薯酒精連續(xù)發(fā)酵工藝研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2005（1），22：36-39.

［3］Carl Lacha，馬兆瑞.蘋果酒釀造技術(shù)［M］.北京：中國輕工業(yè)出社，2004.

Study on the co-immobilization of glucoamylase and yeast by embedding method

AN Yu-hong1，KAN Jian-quan1，*，REN Ting-yuan1，YAN Yue-wen2
（1.Food College of Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Food College of Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Glucoamylase and yeast were co-immobilized by embedding method with polyvinyl alcoho（lPVA）as the embedding materials，and the application of this co-immobilized beads in brews alcohol was inspected in this article.The results showed that the most superior combination of solution for immobilization were H3BO3concentration 4%，chitosan concentration 1.0%，BaCl2concentration 2%，pH 5.0.The optimum processing condition for co-immobilizing the glucoamylase and yeast were enzyme 60mg/mL，yeast 0.01g/mL，PVA 8%.The optimum fermentation condition of this co-immobilized beads were substrate concentration 20%，fermentation temperature 32℃.Under the above conditions，the alcohol content was up to 11%（V/V）.

polyvinyl alcoho（lPVA）；co-immobilization；bedment method

TS261.1+1

A

1002-0306（2010）11-0181-03

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

安玉紅（1982-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)。