桑色素與溶菌酶相互作用的熒光光譜法研究

黃 威，田 皎，趙 楠，張國(guó)文，2，*

（1.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

桑色素與溶菌酶相互作用的熒光光譜法研究

黃 威1，田 皎1，趙 楠1，張國(guó)文1，2，*

（1.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

在生理酸度（pH7.4）條件下，應(yīng)用熒光光譜法研究了桑色素與溶菌酶（LYS）相互作用的光譜特性。研究發(fā)現(xiàn)，桑色素對(duì)溶菌酶的內(nèi)源熒光產(chǎn)生強(qiáng)烈的猝滅作用，其熒光機(jī)理為靜態(tài)與動(dòng)態(tài)并存的復(fù)合猝滅方式。求出了不同溫度下桑色素與溶菌酶作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。由Van’t Hoff方程式計(jì)算了桑色素與溶菌酶反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)：焓變（ΔH）和熵變（ΔS）值分別為-30.26kJ/mol和26.76（J/mol·K），表明桑色素與溶菌酶之間的作用力以靜電引力為主。根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，求出了桑色素與溶菌酶色氨酸殘基之間的結(jié)合距離為4.05nm。同步熒光光譜顯示，桑色素使得溶菌酶的構(gòu)象發(fā)生了變化。

桑色素，溶菌酶，熒光光譜，熱力學(xué)參數(shù)

溶菌酶（lysozyme，縮寫LYS）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子堿性蛋白，由129個(gè)氨基酸殘基組成，包含6個(gè)色氨酸（Trp）和3個(gè)酪氨酸（Tyr）殘基，其中Trp-62和Trp-108是最主要的熒光團(tuán)。溶菌酶是生物體內(nèi)不可缺少的非特異性體液免疫因子，具有抗菌、消炎、抗病毒等諸多的生理功能［1］。溶菌酶能與許多藥物分子結(jié)合，從而協(xié)同發(fā)揮藥效。近年來(lái)，對(duì)藥物與溶菌酶相互作用的研究相當(dāng)活躍［2-4］。桑色素（Morin，結(jié)構(gòu)式如圖1）是從黃桑木、桑橙樹(shù)和許多中草藥中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性［5］。本文采用熒光光譜法研究了生理酸度（pH 7.4）條件下桑色素與溶菌酶的相互作用，測(cè)定其動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和給體-受體間結(jié)合距離，探討了兩者結(jié)合主要驅(qū)動(dòng)力的類型和桑色素對(duì)溶菌酶構(gòu)象的影響。該研究為從分子水平上了解桑色素與溶菌酶相互作用機(jī)制提供重要信息，為進(jìn)一步尋求相關(guān)新藥的發(fā)現(xiàn)、食用功能因子的開(kāi)發(fā)等奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 桑色素的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑色素標(biāo)準(zhǔn)品 用無(wú)水甲醇配制成3.004× 10-3mol/L溶液，使用時(shí)根據(jù)所需進(jìn)行稀釋，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；溶菌酶 用0.05mol/L的NaCl溶液配制成7.86×10-5mol/L的貯備液，溶液保存于4℃的冰箱中備用，北京華美生物工程有限公司產(chǎn)品；pH7.4的 Tris-HCl緩沖溶液；0.10mol/L的NaCl；其他試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為二次蒸餾水。

F-4500型熒光光度計(jì) 日本日立公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10mL的比色管中，依次加入2.0mL pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，2.0mL 0.10mol/L的NaCl溶液，128μL 7.857×10-5mol/L的溶菌酶溶液，以二次蒸餾水定容至10mL。準(zhǔn)確移取3.0mL該溶液于石英熒光池中，用可調(diào)式移液器逐次加入一定體積的桑色素溶液（桑色素的累加體積為90μL），混合均勻并靜置5min。在熒光光度計(jì)上記錄熒光發(fā)射光譜和同步熒光光譜。在熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中，λex=280nm；同步熒光掃描時(shí)取Δλ=15nm和60nm（熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑色素對(duì)溶菌酶熒光的猝滅作用

在溶菌酶結(jié)構(gòu)中，Trp-62和Trp-108是最主要的熒光團(tuán)，它們位于溶菌酶的底部結(jié)合區(qū)。當(dāng)藥物分子與溶菌酶發(fā)生作用，主要體現(xiàn)在Trp-62殘基熒光強(qiáng)度的變化［2］。圖2可以看出，固定溶菌酶的濃度，隨著溶液中桑色素濃度的不斷增加，溶菌酶在344nm左右的內(nèi)源熒光被逐漸猝滅，并產(chǎn)生一定的藍(lán)移，同時(shí)桑色素在510nm附近的熒光強(qiáng)度逐漸增加，而且在449nm處有一個(gè)等發(fā)射點(diǎn)，這些現(xiàn)象表明，桑色素與溶菌酶之間發(fā)生相互作用，使氨基酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生變化［6］。

2.2 熒光猝滅機(jī)理

一般情況下，產(chǎn)生熒光猝滅作用的原因主要有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［6］。為了進(jìn)一步闡明熒光猝滅機(jī)理，用Stern-Volmer方程對(duì)熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：F0/F=1+Kqτ0［Q］=1+Ksv［Q］，式中F0和F分別為未加入和加入桑色素時(shí)溶菌酶的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約10-8s［6］，［Q］為桑色素的濃度。作出F0/F-［Q］關(guān)系圖（見(jiàn)圖3），并計(jì)算出不同溫度下的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（見(jiàn)表1）。若桑色素對(duì)溶菌酶的熒光猝滅機(jī)理為單一的動(dòng)態(tài)或靜態(tài)猝滅方式，F(xiàn)0/F與［Q］間應(yīng)存在線性關(guān)系。由圖3可見(jiàn)，猝滅曲線并未表現(xiàn)出線性關(guān)系，Ksv隨溫度升高有降低趨勢(shì)，表明桑色素對(duì)溶菌酶的熒光猝滅機(jī)理并非單一的靜態(tài)猝滅，而是靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅并存的復(fù)合猝滅機(jī)理［6-7］。

圖2 不同濃度的桑色素對(duì)溶菌酶熒光光譜的影響

圖3 桑色素對(duì)溶菌酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

有機(jī)小分子與生物大分子任一位點(diǎn)發(fā)生作用時(shí)，體系中發(fā)生作用的小分子與未作用的小分子之間處于一種平衡狀態(tài)，這種平衡關(guān)系可以用以下方程描述［8］：lg［（F0-F）/F］=lgK+nlg［Q］，式中K為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg［（F0-F）/F］對(duì)lg［Q］進(jìn)行一元線性回歸，由直線的截距和斜率求得桑色素與溶菌酶作用的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果列于表1中。結(jié)合常數(shù)達(dá)106量級(jí)，表明桑色素與溶菌酶存在較強(qiáng)的結(jié)合，溫度升高使結(jié)合能力稍微減弱，溶菌酶與桑色素間有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 作用力類型

表1 不同溫度下桑色素與溶菌酶作用的猝滅常數(shù)Ksv、結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及熱力學(xué)參數(shù)

有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。當(dāng)溫度變化范圍不大時(shí)，作用過(guò)程的焓變隨溫度的改變可忽略不計(jì)，根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式lgK=-ΔH/2.303RT+ΔS/2.303R（式中K為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)），以lg K對(duì)1/T進(jìn)行一元線性回歸，由直線的斜率和截距計(jì)算出反應(yīng)的焓變（△H）和熵變（△S），再由ΔG=ΔH-TΔS計(jì)算出結(jié)合反應(yīng)的自由能變（ΔG），結(jié)果見(jiàn)表1。Ross［9］總結(jié)出小分子與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力類型的關(guān)系。即當(dāng)ΔS＞0，ΔH＞0為典型的疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH＜0，ΔS＞0時(shí)，主要存在靜電相互作用。由表1可見(jiàn)，ΔG＜0，H＜0，△S＞0，表明桑色素與溶菌酶的作用過(guò)程是一個(gè)熵增加、Gibbs自由能降低的自發(fā)過(guò)程，其作用力主要為靜電引力。

2.5 構(gòu)象研究

同步熒光光譜可以提供熒光發(fā)色基團(tuán)附近微環(huán)境的變化信息，同步熒光波長(zhǎng)Δλ=15nm和60nm時(shí)所測(cè)得的同步熒光光譜分別為酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征［10］，根據(jù)酪氨酸和色氨酸殘基同步熒光光譜的變化可得出其微環(huán)境的變化，進(jìn)而可推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Δλ分別為15nm和60nm時(shí)，增加桑色素的濃度，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了輕微的紅移（移動(dòng)了2.4nm），如圖4A所示，說(shuō)明桑色素與溶菌酶的結(jié)合使得酪氨酸殘基附近微環(huán)境的極性增大、疏水性降低［11］，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有明顯的移動(dòng)（圖4B），表明在結(jié)合過(guò)程中色氨酸殘基附近的微環(huán)境沒(méi)有明顯的改變。

注：cLYS=1.00×10-6mol/L；cmorin=0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00，2.25×10-5mol/L for curves a→j；pH=7.4，T=298K；（A）Δλ=15nm；（B）Δλ=60nm。

2.6 結(jié)合距離

由F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［12］和能量轉(zhuǎn)移效率E與供能體-受能體間距離r以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0的關(guān)系式：E=1-F/F0=R60（/R60+r6）；R60= 8.8×10-25K2n-4ΦDJ；J=∑F（λ）ε（λ）λ4Δλ/∑F（λ）Δλ。式中R0為E=50%時(shí)的臨界距離；K2為偶極空間取向因子，可取供能體-受能體各向隨機(jī)分布的平均值2/3；n為介質(zhì)的折射指數(shù)，一般取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336；ΦD為供能體的熒光量子產(chǎn)率，通常取0.15［13］；F（λ）為熒光供能體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε（λ）為受能體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)，J是供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的吸收光譜之間的光譜重疊積分。圖5為溶菌酶的熒光光譜與桑色素的紫外吸收光譜的重疊圖譜。根據(jù)上述公式分別求得光譜的重疊積分 J=2.225×10-14cm3· L/mol，R0=2.92nm，E=0.122以及桑色素在溶菌酶中的結(jié)合部位距62位色氨酸殘基間的距離r =4.05nm。

圖5 溶菌酶熒光光譜（a）和桑色素吸收光譜（b）的重疊圖譜

3 結(jié)論

靜態(tài)與動(dòng)態(tài)并存的復(fù)合猝滅方式是桑色素對(duì)溶菌酶的內(nèi)源熒光產(chǎn)生猝滅作用的主要原因；桑色素與溶菌酶之間存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，且有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，桑色素在溶菌酶中的結(jié)合部位距62位色氨酸殘基間的距離為4.05nm，靜電引力是結(jié)合作用的主要驅(qū)動(dòng)力；桑色素與溶菌酶結(jié)合使得酪氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致溶菌酶構(gòu)象的改變。

［1］朱奇，陳彥.溶菌酶及其應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報(bào)，1998，33（10）：9-10.

［2］Wang Z，Li D J，Jin J.Study on the interaction of puerarin with lysozyme by spectroscopic methods［J］.Spectrochim，Acta Part A，2008，70：866-870.

［3］Li D J，Zhu J F，Jin J.Spectrophotometric studies on the interaction between nevadensin and lysozyme［J］.J Photoch Photobio A：Chem，2007，189：114-120.

［4］張國(guó)文，陳秀霞，郭金保，等.熒光法研究橙皮苷、淫羊藿苷與溶菌酶的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（1）：184-187.

［5］Fang S H，Hou Y C，Chang W C，et al.Morin sulfates/ glucuronides exertanti-inflammatory activity on activated macrophages and decreased the incidence of septic shock［J］.Life Science，2003，74：743-756.

［6］陳國(guó)珍，黃賢智，許金鉤，等.熒光分析法［M］.第二版.北京：科學(xué)出版社，1990.

［7］Lakowicz J R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，second ed［M］.Plenum Press，New York，1999：237-265.

［8］Hu Y J，Liu Y，Wang J B，et al.Study of the interaction between monoammonium glycyrrhizinate and bovine serum albumin［J］.J Pharm Biomed Anal，2004，36（4）：915-919.

［9］Ross D P，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reaction：contributing to stability［J］.Biochemistry， 1981，20：3096-3099.

［10］Lakowicz J R，Weber G.Quenching of protein fluorescence by oxygen，detection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond time scale［J］.Biochemistry，1973，12：4171-4179.

［11］Wang Y Q，Zhang H M，Zhang G C，et al.Interaction of the flavonoid hesperidin with bovine serum albumin：A fluorescence quenching study［J］.J Lumin，2007，126：211-218.

［12］楊頻，高飛，馬貴斌.生物無(wú)機(jī)化學(xué)導(dǎo)論［M］.西安：西安交通大學(xué)出版社，1991.

［13］Hu Y J，Liu Y，Shen X S，et al.Studies on the interaction between 1-hexylcarbamoyl-5-fluorouracil and bovine serum albumin［J］.J Mol Struct，2005，738：143-147.

Study on the interaction of morin with lysozyme by fluorescence spectroscopy

HUANG Wei1，TIAN Jiao1，ZHAO Nan1，ZHANG Guo-wen1，2，*
（1.College of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

The spectroscopic character between morin and lysozyme（LYS）was studied using fluorescence spectroscopy under the simulative physiological condition（pH7.4）.lt was observed that there was a strong fluorescence quenching reaction of morin to lysozyme，the quenching mechanism was suggested as both static and dynamic quenching for morin-LYS system.The binding constants K and number of binding sites n of morin with lysozyme were obtained by fluorescence quenching method.The thermodynamic parameters of the interaction between morin and lysozyme were measured according to the Van’t Hoff equation.The enthalpy change（△H）and the entropy change（△S）were calculated to be-30.26kJ·mol-1，26.76J·mol-1·K-1respectively，which indicated that the interaction of morin with lysozyme was driven mainly by electrostatic interactions.The binding locality was an area 4.05nm away from tryptophan residue in lysozyme based on F?rster nonradiation energy transfer mechanism.The results of synchronous fluorescence spectra showed that the binding of morin to lysozyme induced conformational changes in lysozyme.

morin；lysozyme；fluorescence spectroscopy；thermodynamic parameters

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0088-04

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

黃威（1987-），男，本科生，研究方向：食品化學(xué)。

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（081040308）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2007GZH1924）。