應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交聯(lián)條件

胡慧玲,唐善虎,,＊,楊蓉生,袁 偉

(1.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院,四川成都 610059; 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交聯(lián)條件

胡慧玲1,唐善虎1,2,＊,楊蓉生2,袁 偉2

(1.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院,四川成都 610059; 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

考察了 pH、催化時(shí)間、催化溫度及加酶量對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用WPI形成交聯(lián)產(chǎn)物的粘度影響,并對(duì)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,找出最佳組合。該研究共分兩個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn) 1考察 pH、時(shí)間、溫度及加酶量單個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)作用的影響;實(shí)驗(yàn) 2是基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用四因素(pH、催化時(shí)間、催化溫度、加酶量)五水平回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì),對(duì)WPI經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)后產(chǎn)生最大粘度的最佳條件進(jìn)行優(yōu)化,以便確定實(shí)驗(yàn)多元回歸方程和獲得較大WPI黏度的最佳條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:交聯(lián)時(shí)間 4h、交聯(lián)溫度 50℃、pH8.0和加酶量 20u/g時(shí),具有最佳粘度值,轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用效果最佳。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,乳清分離蛋白(WPI),粘度,二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

乳清蛋白是從乳清中回收獲得的,是營(yíng)養(yǎng)最全面的一種天然蛋白質(zhì)。多數(shù)乳清蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)效價(jià)(PER值)約 3.1,高于酪蛋白的 PER值(2.5),僅次于雞蛋清的 PER值 (3.9)[1]。然而,乳清蛋白除持水性較好外,熱穩(wěn)定性、起泡性和流變學(xué)等特性在食品工業(yè)應(yīng)用中存在很大的局限性[2-3]。通過(guò)改性,可以顯著改善乳清蛋白的功能特性,如熱穩(wěn)定性、熱凝膠特性、乳化特性等[4]。Sullivan等人 2004年的研究表明,乳清濃縮蛋白經(jīng)變性、均質(zhì)、乳化、酸化、發(fā)酵后通過(guò)核磁共振 (NMR)檢測(cè)與分析,可以提高乳清濃縮蛋白的持水能力[5]。2008年 Zheng等人通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化用堿性蛋白酶水解乳清濃縮蛋白條件的研究,通過(guò)對(duì) pH、溫度、酶/底物濃度三個(gè)因素的控制,堿性蛋白酶水解乳清蛋白能夠明顯降低α-lactalbumin(a-La)和β-lactoglobulin(β-Lg)的抗原性[6]。乳清蛋白的改性方法有化學(xué)改性、物理改性和酶改性,酶改性主要包括水解和交聯(lián)[7]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,E.C.2.3.2.13)能催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng),從而在蛋白質(zhì),多肽以及伯胺之間導(dǎo)入共價(jià)鍵。如果蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基作為酰基受體,可在分子間以及分子內(nèi)形成ε-(γ-Glu)-Lys鍵[8]。乳中蛋白質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性后,可以提高其乳化性、熱穩(wěn)定性;改善其粘度、凝膠強(qiáng)度等流變學(xué)特性,提高其在可食性膜制備等方面的應(yīng)用[9]。乳清蛋白的粘度、熱凝膠性等流變學(xué)特性在食品工業(yè)應(yīng)用中存在很大局限性,也是食品工作者急需解決的難題,目前對(duì)酶改性后的乳清蛋白形成交聯(lián)產(chǎn)物的粘度變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在考察 pH、催化時(shí)間、催化溫度及加酶量對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用WPI形成交聯(lián)產(chǎn)物的粘度影響,同時(shí)應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,找出最佳因素組合,為工業(yè)生產(chǎn)及科學(xué)研究等操作提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 (TG-H) 江蘇一鳴精細(xì)化工提供;乳清分離蛋白粉 美國(guó)哥倫比亞公司,蛋白含量大于 90%;DTT(二硫蘇糖醇) 購(gòu)于Merck公司;其它試劑 均為分析純。

Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó) eppendorf公司;流變儀 美國(guó) Brookfield公司;DELTA320pH計(jì) 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠;電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察交聯(lián)時(shí)間 X1(1、2、4、8、16h)、催化溫度 X2(35、40、45、50、55、60℃)、反應(yīng) pH X3(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和加酶量 X4(20、30、40、50、60u/g)對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 (TG-H)交聯(lián)乳清分離蛋白(WPI)溶液的粘度影響。

1.2.2 四因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,固定WPI濃度為6%,選擇交聯(lián)時(shí)間、pH、交聯(lián)溫度和加酶量四個(gè)因素作為研究對(duì)象,取實(shí)驗(yàn)中效果較好的水平作為各因素的零水平,確定各因素的間距,因素水平編碼表見(jiàn)表 1。

表 1 響應(yīng)面分析的因素和水平

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TG-H催化聚合乳清分離蛋白 準(zhǔn)確稱(chēng)取乳清分離蛋白 6±0.01g,充分溶解于 100mL去離子水中,在 8000r/min,4℃下冷凍離心 10min,除去其中的雜質(zhì)(包括礦物質(zhì)、不溶性蛋白以及一些乳糖)。設(shè)定基礎(chǔ)參數(shù)為溫度 50℃,交聯(lián)時(shí)間 4h,pH為 8.0, TG-H為20u/g,根據(jù)考察的單因素改變相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

1.3.2 交聯(lián)后WPI粘度的測(cè)定 使用 Brookfield流變儀測(cè)試經(jīng) TG-H交聯(lián)后的WPI的粘度,選用圓柱型零號(hào)轉(zhuǎn)子,在 25±0.1℃室溫下,測(cè)定轉(zhuǎn)度為20r/min,剪切率為 24.6s-1下測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次[11]。粘度公式為:

其中:η表示在流體中取兩面積各為 1m2,相距1m,相對(duì)移動(dòng)速度為 1m/s時(shí)所產(chǎn)生的阻力,單位泊 (poise)或者厘泊 (cP)[11],1cP=1×10-3Pa·s= 1mPa·s。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 交聯(lián)時(shí)間對(duì)WPI粘度的影響 TG-H可催化不同來(lái)源的蛋白,相對(duì)而言,乳清蛋白不是 TG-H的很好底物。為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?需要對(duì)乳清蛋白進(jìn)行處理[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳清分離蛋白進(jìn)行預(yù)熱處理

(80℃,15min),之后加入一定量還原劑 DTT (20mmol/L)。在不同時(shí)間條件下 TG-H交聯(lián) WPI所得粘度結(jié)果見(jiàn)圖 1,隨著 TG-H催化交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng),WPI粘度開(kāi)始時(shí)增大,在交聯(lián) 4h時(shí)粘度達(dá)到最大,交聯(lián) 4h后,隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng),WPI粘度反而減小。這是因?yàn)榻宦?lián) 4h后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),合成的生物聚合物分子量會(huì)進(jìn)一步增大,形成超大聚合物而沉淀下來(lái),從而降低WPI溶液粘度值[11]。

圖 1 交聯(lián)時(shí)間對(duì)WPI粘度的影響

2.1.2 pH對(duì)WPI粘度的影響 由圖 2可知,pH在5～7時(shí) TG-H催化WPI的粘度變化不是很明顯,當(dāng)pH在 7～9時(shí),粘度變化值明顯,當(dāng) pH超過(guò) 8時(shí), TG-H催化后的WPI粘度開(kāi)始下降,這是因?yàn)槊傅幕盍κ?pH的影響極為顯著,不同酶具有不同的最適pH,在最適 pH下,酶的活性最高,催化交聯(lián)效果最好。由圖 2所示,TG-H催化WPI存在一個(gè)最佳 pH范圍,約在 8左右,這與趙金和張睿[12]研究認(rèn)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適 pH范圍為 7.0～9.0是相符合的。

圖2 pH對(duì)WPI粘度的影響

2.1.3 溫度對(duì) WPI粘度的影響 由圖 3可知,在35～50℃之間,粘度隨催化溫度升高而增大,當(dāng)溫度超過(guò) 50℃時(shí),TG-H催化交聯(lián)WPI的粘度開(kāi)始下降,這是因?yàn)?TG-H催化WPI聚合有一個(gè)最適溫度范圍。王金水等人[13]報(bào)道轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適作用溫度為 50～55℃。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TG-H催化WPI粘度達(dá)到最大時(shí)的溫度為 50℃左右,這與王金水等人報(bào)道的結(jié)果相符合。

圖 3 溫度對(duì) TG-H交聯(lián)WPI粘度的影響

2.1.4 加酶量對(duì)WPI粘度的影響 一般來(lái)說(shuō),酶/底物值越大,越有利于酶完全地催化底物。當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),加酶量會(huì)存在一個(gè)臨界值[13]。由圖 4可知,當(dāng)加酶量在 20～30u/g,粘度值隨加酶量增加而升高;當(dāng)加酶量在 30～40u/g時(shí),粘度值隨加酶量增加而降低,可見(jiàn)在該實(shí)驗(yàn)條件下 30u/g加酶量是酶催化聚合的臨界加酶量。酶對(duì)底物的催化量與催化效率是相互矛盾的,有關(guān)這一點(diǎn)可以明顯地從圖中看出,底物濃度固定,加酶量越多,催化效率越低。對(duì)于一個(gè)催化反應(yīng),需要綜合考慮此二者的關(guān)系,在保證達(dá)到最大粘度值的條件下,盡可能地提高催化效率,本實(shí)驗(yàn)最佳加酶量可選 20～30u/g。

圖 4 加酶量對(duì) TG-H交聯(lián)WPI粘度的影響

2.2 四因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)回歸計(jì)劃R436R0C[10],編制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入表 2。各種組合處理的 WPI溶液的粘度在 1.61～4.05mPa·s。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到影響乳清分離蛋白粘度 (η)的回歸方程:

其模型與單因素實(shí)驗(yàn)效果相同,為進(jìn)一步確定各因素對(duì)交聯(lián)后乳清分離蛋白粘度的影響程度,對(duì)所得的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,其結(jié)果見(jiàn)表 3。

粘度值大于 3.07mPa·s的 105個(gè)方案中的各個(gè)因素分布見(jiàn)表 4。對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn):F1= MS回歸/MS剩余=6.47>F0.05(14,21),說(shuō)明得到的回歸方程顯著,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與采用的數(shù)學(xué)模型相符合,不需要改變數(shù)學(xué)模型。進(jìn)行失擬均方與誤差的 F值檢驗(yàn):F2=MS失擬/MS誤差=2.81

表 2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

表 3 回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方差分析表

3 結(jié)論

3.1 由單因素實(shí)驗(yàn)得到轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián) 6%乳清分離蛋白 (WPI)溶液的最佳粘度條件為:交聯(lián)時(shí)間為 4h,交聯(lián)溫度為 50℃,pH為 8.0,酶的添加量最佳范圍為 20～30u/g,考慮到酶的來(lái)源及經(jīng)濟(jì)因素,選擇添加量為 20u/g。

3.2 采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳清分離蛋白 (WPI)的工藝條件進(jìn)行研究,在交聯(lián)時(shí)間、溫度、pH、加酶量之間建立的二次回歸數(shù)學(xué)模型為:由該模型模擬所得的粘度值與單因素實(shí)驗(yàn)效果是基本一致的。

3.3 本研究實(shí)現(xiàn)了乳清分離蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)后的粘度值的較大提高,在未經(jīng)改性前 6%WPI的粘度值為 1.61mPa·s,改性后的 6%WPI粘度值可高達(dá) 4.05mPa·s,在食品材料研究和開(kāi)發(fā)中具有一定的應(yīng)用潛力。

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Opti m ization ofwhey protein cross-linking via transglutam inase using quadratic regression rotational com binational design

HU Hui-ling1,TANG Shan-hu1,2,＊,YANG Rong-sheng2,YUANW ei2
(1.College ofMaterial and Chemistry&Chemical Engineering,Chengdu University of Technology,Chengdu 610059,China; 2.College ofLife Science&Technology,SouthwestUniversity forNationalities,Chengdu 610041,China)

The ob jec tives of this s tudy was to inves tiga te the influence of pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture and am ount of transg lutam inase on W PI c ross-linking and the changes of viscos ity of the p roduc t,and to op ti m ize the fac toria l com b ina tions.Two exp e ri m ents we re conduc ted.In exp e ri m ent1,effec ts of pH,ti m e,temp e ra ture or enzym e am ount of ind ividua l fac tor on c ross-linking we re inves tiga ted.In exp e ri m ent2,four fac tors(pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture,enzym e am ount)w ith five leve ls we re a rranged w ith orthogona l rota tiona l des ign based on the s ing le-fac tor tes t results.Viscos ities we re m easured and da ta we re ana lyzed w ith m ulti p le reg ress ion.The exp e ri m enta l results showed tha t a t pH8.0,50℃,add ition of20u/g of transg lutam inase,and c ross-linking for4h, had the op ti m a l viscos ity.

transg lutam inase;whey p rote in isola te;viscos ity;quad ra tic reg ress ion rota tiona l des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)05-0188-04

2009-08-10 ＊通訊聯(lián)系人

胡慧玲(1984-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù)及其應(yīng)用。

四川省科技支撐計(jì)劃(07NG111-002)。