市售鯽魚(yú)體內(nèi)菌株及其抗生素耐藥性分新

侯進(jìn)慧,高兆建,蔡 侃,葉 駿

(徐州工程食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221008)

市售鯽魚(yú)體內(nèi)菌株及其抗生素耐藥性分新

侯進(jìn)慧,高兆建,蔡 侃,葉 駿

(徐州工程食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221008)

分離健康鯽魚(yú)體內(nèi)菌株,通過(guò)顯微鏡觀察和 16S rDNA分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶菌株篩選。分離到的菌株分別屬于假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌等。在美國(guó)國(guó)家生物信息中心NCB I Genbank基因庫(kù)中提交了其中兩個(gè)菌株 16S r DNA序列,登錄號(hào)是:FJ796224和 FJ796225。篩選到多株產(chǎn)淀粉酶菌株,其中產(chǎn)酶活性較高的菌株命名為Aeromonas veroniiF2。在鯽魚(yú)腸道沒(méi)有篩選到產(chǎn)纖維素酶菌株?？股貦z測(cè)分析顯示,鯽魚(yú)體內(nèi)抗卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素三種藥物的細(xì)菌有 11.29%,顯示鯽魚(yú)體內(nèi)菌株抗藥性比從田野環(huán)境中獲得的菌株高 5～6倍,這需要引起人們的關(guān)注。

鯽魚(yú),細(xì)菌,16S rDNA,耐藥性

魚(yú)類(lèi)是人們重要的蛋白質(zhì)類(lèi)食物來(lái)源,為滿足人們對(duì)優(yōu)質(zhì)食物蛋白質(zhì)不斷增長(zhǎng)的需求,魚(yú)源性食品生產(chǎn)迫切需要增加投入和提高產(chǎn)量,同時(shí)應(yīng)該增加魚(yú)類(lèi)食品的相關(guān)研究。魚(yú)類(lèi)體內(nèi)的細(xì)菌對(duì)于魚(yú)類(lèi)的加工保鮮過(guò)程是非常關(guān)鍵的,也常常是魚(yú)肉腐敗的主要微生物來(lái)源。同時(shí),由于魚(yú)類(lèi)腸道菌是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分,影響著魚(yú)類(lèi)消化、免疫、生長(zhǎng)和發(fā)育等過(guò)程,研究魚(yú)類(lèi)腸道菌不僅對(duì)于食品加工儲(chǔ)存過(guò)程有一定的啟示,對(duì)監(jiān)測(cè)鮮活魚(yú)肉產(chǎn)品也可以提供資料參考。關(guān)于魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物腸道菌的研究主要涉及到腸道菌群的形成、結(jié)構(gòu)和數(shù)量、生理功能以及影響菌群結(jié)構(gòu)的因素、與益生菌的關(guān)系等方面[1-2]。對(duì)于魚(yú)類(lèi)腸道菌的研究中,人們經(jīng)常關(guān)注腸道菌群的分析和腸道產(chǎn)酶菌的研究,在一些魚(yú)類(lèi)中已經(jīng)有了相關(guān)的研究報(bào)道,此類(lèi)研究在鯽魚(yú)中報(bào)道較少[3-5]。腸道產(chǎn)酶菌產(chǎn)生的胞外酶類(lèi),比如纖維素酶和淀粉酶,可以起到輔助消化的作用,促進(jìn)魚(yú)類(lèi)對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)的消化吸收。鯽魚(yú)是我國(guó)重要淡水魚(yú)類(lèi),也是人們?nèi)粘ｔ~(yú)肉蛋白的重要來(lái)源。對(duì)于鯽魚(yú)腸道細(xì)菌的分析,不僅可以使研究者掌握其腸道菌群的情況,也可以為研究食品質(zhì)量檢測(cè)、飼料添加劑等提供有價(jià)值的資料。本研究對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售供食用的鯽魚(yú)腸道微生物進(jìn)行分離和抗生素抗性分析,并采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)對(duì)其中的微生物種類(lèi)進(jìn)行了分析鑒定,對(duì)一些產(chǎn)分泌性酶類(lèi)的微生物進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)篩選到的菌株 分離自市場(chǎng)出售供食用的健康鯽魚(yú)體內(nèi)腸道組織;分析純生化試劑、PCR反應(yīng)引物 購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP等分子生物學(xué)試劑 購(gòu)自天根生化科技 (北京)有限公司;培養(yǎng)基[6-7]LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g,酵母膏 5g, NaCl 10g,去離子水定容至 1L,滅菌備用,每 1L固體LB培養(yǎng)基中需再加入 12g瓊脂粉;產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基:羧甲基纖維素 10g,蛋白胨 10g,酵母膏5g,KH2PO41g,MgSO40.2g,NaCl 10g,葡萄糖 2g,瓊脂12g,去離子水定容至 1L,滅菌備用;產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基:可溶性淀粉 10g,蛋白胨 5g,酵母膏 10g,瓊脂12g,蒸餾水100mL,去離子水定容至1L,滅菌備用;魯哥氏碘液:將 6g KI溶解于 20mL蒸餾水中,再加入 4g碘充分溶解,去離子水定容至 1L,貯存于棕色瓶中備用。

1.2 產(chǎn)酶菌株篩選[6-7]

產(chǎn)纖維素酶菌株篩選:將 0.5%的剛果紅倒入培養(yǎng)基中染色5min,倒掉剛果紅后,使用 5%的NaCl溶液浸泡脫色 1h,若菌株周?chē)型该魉馊Τ霈F(xiàn),則說(shuō)明該菌株產(chǎn)纖維素酶。產(chǎn)淀粉酶菌株篩選:將盧哥氏碘液倒入平板中,若出現(xiàn)不能被染色的透明水解圈,則說(shuō)明該菌株可產(chǎn)生淀粉酶。測(cè)量水解圈與菌落直徑的比值初步確定產(chǎn)酶活性高的菌株。

1.3 菌株抗性檢測(cè)

使用不同抗生素固體培養(yǎng)基,分析鯽魚(yú)腸道菌株的抗藥性。使用的抗生素及濃度分別是:卡那霉素 (30μg/mL)、氨芐青霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取

提取各菌株基因組DNA,作為 PCR反應(yīng)模板[5]。

1.5 細(xì)菌 16S rDNA序列分析

用于擴(kuò)增 16S r DNA序列的引物是:

F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,

R:GGTTACCTTGTTACGACTT。

將各菌落 16S r DNA送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,由測(cè)序儀器 AB I PR IS M 3730進(jìn)行測(cè)序。將獲得的 16S r DNA序列提交NCB I網(wǎng)站,獲得登錄號(hào)。使用 BLAST程序在 GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì),分析各產(chǎn)酶菌株的分類(lèi)學(xué)地位,并分析篩選菌株與序列相近菌株的演化關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離鯽魚(yú)腸道菌株

從鯽魚(yú)腸道分離到 62株細(xì)菌,其中產(chǎn)淀粉酶菌株有26株,占總菌株的41.94%。分析獲得產(chǎn)淀粉酶菌株的水解圈與菌落直徑關(guān)系發(fā)現(xiàn),菌株 F2的淀粉酶活性較高,達(dá)到 3.25倍。在鯽魚(yú)腸道中沒(méi)有篩選到產(chǎn)纖維素酶菌株。

2.2 菌株抗性

腸道菌株抗生素抗性分析結(jié)果顯示,分離株菌中有 8株抗卡那霉素 (占 12.90%),有 18株抗氨芐青霉素(占 29.03%),有 7株抗氯霉素 (占 11.29%);抗兩種抗生素情況是:抗卡那霉素和氨芐青霉素的菌株有 8株 (占 12.90%),抗卡那霉素和氯霉素有 7株 (占 11.29%),抗氨芐青霉素和氯霉素有 7株 (占11.29%);抗三種藥物的菌株有 7株(占 11.29%)。

2.3 基因組DNA提取和 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

提取獲得各菌株質(zhì)量較高的基因組 DNA,將PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析顯示,擴(kuò)增出 F1、F2、F6、F14、F31、F40等菌株 16S r DNA片段,無(wú)明顯雜帶(圖 1)。

圖 1 16S r DNA電泳結(jié)果

2.4 16S rDNA測(cè)序分析和序列提交

通過(guò)測(cè)序確定各菌株 16S r DNA序列。使用BLAST程序?qū)⒏餍蛄性贜CB I網(wǎng)站的比對(duì)結(jié)果顯示: F1序列 (781bp)與 Aerom onas m ediastrain 480a的16S核糖體序列相似性是 100%;F2序列(1348bp)與Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖體序列相似性最高,達(dá)到 99%;F6序列 (965bp)與 Aerom onas hydrophila的 16S核糖體序列相似性最高,達(dá)到99%;F14序列 (1404bp)與 Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖體序列相似性是 100%;F31序列(655bp)與 Shewanella putrefaciensCN-32的 16S核糖體序列相似性是 100%;F40序列 (548bp)與Pseudom onas sp.bf-1的 16S核糖體序列相似性是100%。已將 F2和 F14的序列提交到美國(guó)國(guó)家生物信息中心 NCB I基因數(shù)據(jù)庫(kù)中,序列號(hào)分別是: FJ796224和 FJ796225。菌株 F2和 F14比較分析結(jié)果如圖 2,顯示出兩菌株均屬于氣單胞菌屬。

圖 2 F2的 16S rDNA序列分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文對(duì)市場(chǎng)上出售的食用鯽魚(yú)腸道菌株進(jìn)行了分析,并對(duì)其中產(chǎn)分泌性纖維素酶、淀粉酶的菌株分別進(jìn)行了篩選。結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)一些菌株進(jìn)行分類(lèi)分析后,確定了它們的分類(lèi)地位,并將獲得的菌株 16S r DNA序列提交到了美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的基因庫(kù)中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所分析的鯽魚(yú)體內(nèi)微生物分別是屬于假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌等類(lèi)別的細(xì)菌。對(duì)于篩選到的菌株分析顯示,其中有 41.94%的菌株可產(chǎn)生淀粉酶,但未篩選到纖維素酶菌株。抗生素抗性檢測(cè)結(jié)果顯示,鯽魚(yú)體內(nèi)細(xì)菌中,抗生素抗性菌株較多,其中有 11.29%的菌株可以抗卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素三種抗生素,顯示鯽魚(yú)體內(nèi)菌株抗藥性比從田野環(huán)境中獲得的菌株高 5～6倍,這一結(jié)果應(yīng)該引起人們足夠的重視。細(xì)菌的耐藥性會(huì)導(dǎo)致病原菌防治難度加劇,其長(zhǎng)期結(jié)果是導(dǎo)致感染性疾病的防治困難加大,對(duì)人類(lèi)的健康造成嚴(yán)重危害[8]。食品中抗生素抗性菌株,特別是抗多種抗生素的菌株過(guò)多,很可能是在魚(yú)類(lèi)飼養(yǎng)過(guò)程中接觸或注射了過(guò)多抗生素的結(jié)果。從食品安全角度考慮,現(xiàn)在應(yīng)該對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)限制使用抗生素,防止細(xì)菌的多種藥物耐受性現(xiàn)象的繼續(xù)增加。在魚(yú)類(lèi)或肉類(lèi)食品安全方面,需要關(guān)注抗生素的危害,在檢測(cè)方面也需要關(guān)注抗生素殘留的檢測(cè)。檢測(cè)魚(yú)類(lèi)腸道菌群的抗生素抗性,為我們分析魚(yú)類(lèi)食品飼養(yǎng)過(guò)程中抗生素濫用情況提供了一種分析途徑。

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Analysis of bacterial strain from Carassius auratus sold in m arket and its drug resistance

HOU Jin-hui,GAO Zhao-jian,CA I Kan,YE Jun
(Food Engineering(Bioengineering)Department,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

In this p ap e r,bac te ria l s tra ins we re isola ted from hea lth Ca rass ius aura tus.The s tra ins we re c lass ified w ith m ic roscop es and16S rDNA ana lys is,ce llulase and am ylase p roduc ing s tra in we re se lec ted.The isola ted s tra ins we re Pseudom onas,Ae rom onas,Shewane lla.Two16S rDNA sequences we re subm itted to NCB I Genbank and access ion num be rs we re FJ796224and FJ796225.Seve ra l s tra ins p roduced am ylase and a bac te ria l s tra in w ith highe r am ylase ac tivity was Ae rom onas ve ronii F2.No s tra in w ith ce llulase ac tivity was found.Antib iotic res is tance ana lys is revea led tha t11.29%of the bac te ria from Ca rass ius aura tus we re kanam yc in,amp ic illin and chlorom yce tin res is tant s tra ins,which was5to6folds highe r than s tra ins from fie ld environm ent,the result should be p a id sp ec ia l a ttention.

Ca rass ius aura tus;bac te rium;16S rDNA;d rug res is tance

TS254.1

A

1002-0306(2010)05-0202-03

2009-06-24

侯進(jìn)慧(1980-),男,博士,講師,研究方向:食品生物技術(shù)。

校引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目;校科研項(xiàng)目(XKY2008110)。