魷魚副產(chǎn)物自溶水解過程的生化變化及其機理

姜艷喜，張建友，丁玉庭

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

魷魚副產(chǎn)物自溶水解過程的生化變化及其機理

姜艷喜，張建友，丁玉庭*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

系統(tǒng)地研究了魷魚加工副產(chǎn)物內(nèi)源性蛋白酶自溶水解過程中氨基氮、總可溶性氮（TSN）、TCA可溶性氮（TCA-N）、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、pH、總酸、水解度（DH）以及游離脂肪酸的變化。確定最佳自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH、水解時間39h。自溶水解39h離心后上清液中的氨基氮、TSN、TCA-N的含量分別為0.626±0.025、1.234±0.049、0.589±0.018g/100mL，TVB-N含量為 59.10±1.28mg/100mL，蛋白質(zhì)水解度達到23.89%±0.13%。魷魚加工副產(chǎn)物內(nèi)源性蛋白酶可以較好地水解其自身蛋白質(zhì)，在39h的自溶水解過程中沒有腐敗現(xiàn)象發(fā)生。

魷魚加工副產(chǎn)物，自溶，pH，氨基氮，水解度

隨著魷釣規(guī)模的不斷壯大，我國的魷魚產(chǎn)量不斷增加。目前，我國魷釣船達到400多艘，年產(chǎn)量70多萬t，年捕撈產(chǎn)值60多億元，占世界魷魚捕獲量的17%左右，在國際魷釣業(yè)中占據(jù)著重要地位。魷魚加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，主要由頭、內(nèi)臟、皮、鰭和小導(dǎo)管組織組成，其中魷魚皮占8%～13%，肝臟占濕重的15%左右［1］，精巢組織約占7%左右［2］。以往這些副產(chǎn)物常做掩埋和丟棄處理，不僅污染環(huán)境而且浪費資源［3］。近年來有關(guān)如何有效利用魷魚加工副產(chǎn)物已經(jīng)成為新的研究熱點。本文系統(tǒng)研究了魷魚加工副產(chǎn)物內(nèi)源性蛋白酶自溶水解工藝，測定其指標(biāo)變化并闡述原因，探索魷魚副產(chǎn)物的加工新途徑。這對于魷魚副產(chǎn)物的綜合利用和高值化加工具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚加工副產(chǎn)物 中國水產(chǎn)舟山海洋漁業(yè)公司提供，實驗室貯藏于-20℃冰柜中。

CR21GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；752N紫外可見分光光度計、pHS-3C型pH計 上海精科實業(yè)有限公司；450Watt德國博朗多功能食品調(diào)理機 波蘭博朗有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；98-Ⅱ型強磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇江南儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 自溶水解液的制備 魷魚副產(chǎn)物在冷凍狀態(tài)下經(jīng)切塊后置于打漿機中斬拌1min成漿，分別準(zhǔn)確稱取50g漿液于250mL具塞三角瓶中，加入50g蒸餾水（水/原料，w/w），1.0mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)至所需的pH，于恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)自溶水解后沸水浴煮沸20min滅酶，流水冷卻，22000×g離心15min。離心后分層示意圖如圖 1，這與 Omid Tavakoli和 Hiroyuki Yoshida的研究結(jié)果相似［4］，分別取清液以及脂肪層進行測定分析。工藝流程如下：

魷魚副產(chǎn)物漿→加水混合→調(diào)pH→恒溫水浴自溶→滅酶（100℃下保持20min）→流水冷卻→離心（22000×g，15min）→離心清液、脂肪

表1 魷魚加工副產(chǎn)物的基本成分

圖1 水解液離心后示意圖

1.2.2 理化指標(biāo)測定 水分采用直接干燥法（GB/T 5009.3-1985）；灰分采用高溫灼燒法（GB/T 5009.4-2003）；脂肪采用索式抽提法（GB/T 14772-2008）；含鹽量（以NaCl計）采用硝酸銀滴定法（GB/T 12457 -2008）；總糖采用苯酚-濃硫酸比色法［5］；pH測定采用酸度計；總酸含量的測定采用中和滴定法（GB/T 1245-90）；氨基氮含量的測定采用甲醛滴定法（GB 5009.39-85 1996）；揮發(fā)性鹽基氮采用半微量擴散法［6］；游離脂肪酸含量以及酸價的測定采用KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定法［7］；總氮、粗蛋白、總可溶性氮采用凱氏定氮法［8］；TCA可溶性氮（TCA-N）含量的測定采用M.T.Morrissey等的方法［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 魷魚加工副產(chǎn)物的宏量成分組成

經(jīng)過測定，魷魚加工副產(chǎn)物中的宏量營養(yǎng)成分組成如表1所示。

從表1可以看出，魷魚加工副產(chǎn)物（頭、足、鰭以及內(nèi)臟等）蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量中等，是較好的蛋白質(zhì)資源，可以作為蛋白資源進一步加工利用，提高其經(jīng)濟價值，避免資源浪費以及環(huán)境污染。它可以提供飼用的水解蛋白，也可以提供食用的食品風(fēng)味添加劑，以此促進魷魚加工業(yè)的快速發(fā)展。

2.2 自溶水解條件的確定

以氨基氮含量、揮發(fā)性鹽基氮含量、水解度（DH）、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為相應(yīng)指標(biāo)，水解時間、溫度、初始pH和料水比為影響因素進行單因素實驗，確定最佳的自溶水解條件。

2.2.1 最佳料水比的確定 魷魚加工副產(chǎn)物利用內(nèi)源性蛋白酶水解的反應(yīng)必須在一定的水溶液中進行，這是因為蛋白酶必須溶解在相應(yīng)的緩沖液中才能均勻分散在整個體系中，才能與底物接觸并對其發(fā)生作用。而且有時水也作為一種反應(yīng)物參與酶解反應(yīng)。此外，水解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)也可在水溶液中迅速擴散，防止局部濃度過高而抑制水解反應(yīng)的進行。

由圖2可以看出，隨著料水比的降低，水解度（DH）、蛋白質(zhì)回收率、TCA可溶性氮（TCA-N）逐漸增加，分別由料水比2∶1時的15.37%±0.46%、25.95%± 1.04%、25.99% ±1.04%增加到料水比 1∶2時的31.40%±1.26%、42.25%±1.69%、40.25%±1.61%；而氨基氮隨著料水比的降低而降低，由料水比2∶1時的0.815±0.016g/100mL降低到料水比1∶2時的0.314±0.006g/100mL；說明底物濃度越小越有利于酶解進行。這是因為：a.反應(yīng)是在水溶液中進行的，水在反應(yīng)中有利于分子的擴散和運動。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時就使水的有效濃度降低，使反應(yīng)速度下降；b.一定的底物是與酶分子中一定的活性部位結(jié)合的，并形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物。過量的底物分子聚集在酶分子上就可能形成無活性的中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物是不可能分解為反應(yīng)產(chǎn)物的。但是底物濃度并不是越低越好，底物濃度過低（即加水量過大）會使酶解液中氨基氮濃度過低，而且在以后的加工處理過程中還要進行濃縮、干燥，必然增加工藝的復(fù)雜性以及成本。

2.2.2 最佳自溶溫度的確定 溫度會影響酶和底物的結(jié)合、最大速率（Vmax）、酶和底物分子解離基團的解離常數(shù)（pK）、酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等［10］。魷魚副產(chǎn)物內(nèi)源性蛋白酶在35～65℃的自溶水解度與溫度的關(guān)系如圖3所示。

圖2 不同料水比對自溶水解的影響

圖3 不同的自溶水解溫度對水解度的影響

可以看出，35～45℃的溫度區(qū)間內(nèi)，水解度呈現(xiàn)上升趨勢，由 19.34% ±0.39%升高到 23.31% ± 0.47%。而45～60℃呈現(xiàn)下降趨勢，由 23.31% ± 0.47%下降到16.05% ±0.32%；而60℃到65℃則下降不明顯。65℃時為15.21% ±0.30%，而原料初始的水解度就是14.98%±0.15%，表明此時的內(nèi)源酶系基本失活。由此我們確定45℃為最佳的自溶水解溫度。

2.2.3 最佳自溶水解pH的選擇 pH對酶促反應(yīng)的影響是多方面的，過酸或過堿都可使酶空間構(gòu)象改變，使酶失活。根據(jù)過酸或過堿的程度不同，酶將遭受可逆或不可逆失活，并且pH可以改變底物分子及酶的解離狀態(tài)影響它們結(jié)合，從而降低酶活性［10］。

圖4 不同的初始pH對氨基氮濃度的影響

由圖4可以看出，離心清液中的氨基氮濃度隨著初始pH的不同而發(fā)生明顯的變化。在初始pH為6.0時氨基氮的濃度最高，而魷魚加工副產(chǎn)物的自身pH是6.02±0.2，所以便于控制和節(jié)約資源我們選擇自然的pH進行自溶水解，即無需添加酸堿來校準(zhǔn)初始pH。

2.2.4 最佳自溶水解時間的確定 酶解時間同樣是影響水解反應(yīng)的重要因素，過短則酶解反應(yīng)不徹底，既造成資源浪費又達不到理想的效果，過長則由于內(nèi)源混合酶系的活力逐漸降低、底物濃度減小以及產(chǎn)物的抑制，導(dǎo)致水解緩慢，此時就會浪費時間，所以應(yīng)當(dāng)控制適當(dāng)?shù)拿附鈺r間。

圖5 不同自溶時間對水解效果的影響

由圖5可以看出，離心清液中的氨基氮濃度隨著水解時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。在最初的12h內(nèi)，由0.213±0.006g/100mL上升到0.578±0.017g/100mL，增加迅速；而在第12h到第39h的時間內(nèi)增加緩慢，到第39h氨基氮濃度達到0.649±0.019g/100mL，較前12h增加速度明顯變緩。自溶水解時間延長至63h，氨基氮濃度為0.677±0.020g/100mL。綜合時耗、動力能源等因素，選擇39h最為最佳的自溶水解時間。

綜上所述，以氨基氮含量、水解度（DH）、揮發(fā)性鹽基氮含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為指標(biāo)，通過單因素實驗確定最佳的自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿調(diào)即可）、自溶水解時間39h。

2.3 自溶水解液pH和總酸含量的變化

在最適自溶條件下，水解液的pH和總酸含量的變化如圖6所示。

由圖6可以看出，魷魚廢棄物自溶水解過程中pH略有下降，由自溶水解初期的6.10±0.05到水解基本結(jié)束時的5.90±0.01。而在水解初期水解離心清液的pH下降速度較迅速，主要是因為氨基酸中羧基的解離度遠大于氨基的解離度，氨基酸的溶液會釋放出大量的質(zhì)子；再則由于肌肉中大部分的有機酸類成分迅速溶出，導(dǎo)致水解液的pH降低。魚貝類肌肉的酸性組分包括乳酸、丙酸、丙酮酸、草酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸等，由圖6可以看出，大部分肌肉的酸性組分在自溶水解的前6h即釋放出來，此時總酸含量為1.350±0.027g/100mL，而后上升趨勢變緩。這是由于自溶水解6h后，魷魚廢棄物的微觀組織結(jié)構(gòu)已基本被破壞，自溶水解物由半固態(tài)變?yōu)榭梢宰杂闪鲃拥囊后w，隨著自溶時間的延長，總酸的含量增加緩慢，而這個階段增加的有機酸主要來自微生物生長產(chǎn)酸，經(jīng)過39h的自溶水解后，水解離心液中總酸含量達到1.581±0.032g/100mL。

圖6 魷魚廢棄物自溶水解液pH和總酸含量的變化

2.4 水解液中氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的變化

在最適自溶條件下的水解液的氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的變化如圖7所示。

圖7 魷魚廢棄物自溶水解液中氨基氮、總可溶性氮和TCA可溶性氮的含量的變化

水解前水解液有0.837±0.033g/100mL的可溶性氮溶于水，這主要包括肌漿蛋白氮，內(nèi)源酶已經(jīng)酶解的氨基氮。水解前的6h內(nèi)，水解液中水溶性蛋白質(zhì)（即總可溶性氮）迅速增加，這是由于水不溶性的蛋白質(zhì)在內(nèi)源蛋白酶的作用下水解成為多肽和氨基酸而溶于水，隨后的時間內(nèi)總可溶性氮的含量保持著小幅度的增長。與總可溶性氮不同的是，水解液中氨基酸含量（即氨基氮的含量）在0～9h都保持著相對較大幅度的增長，由0h的0.374±0.015g/100mL到9h的0.529±0.021g/100mL，9h后增長變緩，原因在于開始時內(nèi)臟的多種蛋白酶酶活力較強，催化速率較快，生成的肽、氨基酸成分較多，隨著自溶水解的延長，蛋白酶活力逐漸減弱，催化速率逐漸降低。自溶水解基本結(jié)束時水解離心清液中的氨基氮的含量達到0.626±0.025g/100mL。

2.5 魷魚廢棄物自溶水解過程中水解度（DH）和TVB-N含量的變化

在最適自溶條件下的水解度（DH）和TVB-N含量的變化如圖8所示。

圖8 魷魚自溶水解過程中水解度的變化

圖8顯示了魷魚加工副產(chǎn)物自溶水解過程中DH隨時間的變化趨勢，可以看出，在最初的9h內(nèi)水解度增加比較明顯，而后水解度增加變緩。當(dāng)水解到39h時，水解度達到23.89%±0.13%，在最初的0h有水解產(chǎn)物是因為魷魚副產(chǎn)物產(chǎn)生的過程中，所處環(huán)境的影響因素使內(nèi)源性蛋白酶也已發(fā)揮作用產(chǎn)生了游離氨基酸。水解度在開始增加較快是由于內(nèi)源性的組織蛋白酶在開始時活力較高，催化蛋白水解的速率快，氨基酸的含量增加較快。隨著時間的延長，酶活力逐漸降低，以及底物濃度變小和產(chǎn)物的抑制作用，催化速率變小，導(dǎo)致DH增加緩慢。

魷魚副產(chǎn)物自溶開始時的TVB-N值為23.50± 1.20mg/100mL，在第 9h時達到 44.20±1.37mg/ 100mL，增加比較迅速；而后趨于平緩，30h時達到53.11±0.75mg/100mL；隨后呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，到第39h達到59.10±1.28mg/100mL。自溶水解過程中TVB-N含量增加的原因可能是由于蛋白質(zhì)和氨基酸在其本身含有的脫羧酶、脫氨酶和細菌生長所產(chǎn)生的細菌性脫氨酶、脫羧酶共同作用下脫氨的結(jié)果［11］。

2.6 水解液中游離脂肪酸的變化

在最適自溶條件下的游離脂肪酸的變化和酸價的變化如圖9所示。

圖9 魷魚廢棄物自溶水解過程中游離脂肪酸和酸價的變化

游離脂肪酸和酸價的多少是衡量油脂好壞的重要指標(biāo)之一。實驗結(jié)果表明，水解15h后，油脂的酸價達到 21.34±0.42mgKOH/g，39h達到 25.86± 0.51mgKOH/g。酸價在水解過程中不斷上升的主要原因是脂肪被內(nèi)源性脂肪酶水解以及脂肪氧化的結(jié)果［12］。

3 結(jié)論

以氨基氮含量、DH、TVB-N含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為指標(biāo)通過單因素實驗確定最佳的自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿調(diào)即可）、自溶水解時間39h。研究魷魚廢棄物的自溶水解過程中的各種理化指標(biāo)的變化并分析其變化原因，得出：魷魚加工副產(chǎn)物的自溶水解過程是利用自身的內(nèi)源蛋白酶系，借助于適宜的反應(yīng)條件將自身的蛋白質(zhì)分解為氨基酸、多肽的過程。其中氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的含量隨著水解時間的延長而增加；伴隨的還有揮發(fā)性鹽基氮此類影響風(fēng)味的物質(zhì)，它是由自身的脫羧酶、脫氨酶和細菌滋生產(chǎn)生的細菌性脫氨酶、脫羧酶共同作用下將蛋白質(zhì)和氨基酸脫氨產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)脫除；同時內(nèi)源性的脂肪酶以及脂肪本身的氧化作用也會導(dǎo)致自溶過程中的游離脂肪酸的含量增加。

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Biochemical changes in the squid processing wastes’auto-hydrolysate and mechanism analysis

JIANG Yan-xi，ZHANG Jian-you，DING Yu-ting*
（Zhejiang University of Technology，College of Biological and Environmental Engineering，Hangzhou 310014，China）

Biochemical changes in auto-hydrolysis of squid processing wastes were investigated.The optimum condition of auto-hydrolysis were as follow：material-water ratio 1∶1，temperature 45℃，the original pH，the time of auto-hydrolysis 39h.Results showed that amino nitrogen，TSN，TCA-N，TVB-N and the degree of hydrolysis was 0.626±0.025，1.234±0.049，0.589±0.018g/100mL，59.10±1.28mg/100mL，23.89% ±0.13%，respectively.ln a word，the endogenous protease in squid processing wastes can hydrolyze protein effectively and there was no putrefaction in the processing.

squid by-products；auto-hydrolysis；pH；amino nitrogen；the degree of hydrolysis

TS254.9

A

1002-0306（2010）12-0142-04

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

姜艷喜（1983-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)?；痦椖浚赫憬】萍紡d科研社會發(fā)展項目（2008C23021）。