利用乳清為主要原料高密度培養(yǎng)干酪乳桿菌

李 云，黃志丹，鄭麗芬，彭智鵬，葉曉靜

（韓山師范學(xué)院生物系，食品與發(fā)酵工程研究所，廣東潮州521041）

利用乳清為主要原料高密度培養(yǎng)干酪乳桿菌

李 云，黃志丹，鄭麗芬，彭智鵬，葉曉靜

（韓山師范學(xué)院生物系，食品與發(fā)酵工程研究所，廣東潮州521041）

利用乳清為原料高密度培養(yǎng)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102），用于生產(chǎn)濃縮發(fā)酵劑。在5L發(fā)酵罐研究了pH控制和補料培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，加堿控制pH對菌體生長有利，控制pH為6.0時的菌體干重最高。不同堿液對菌體的生長有顯著影響，流加NH3·H2O菌體的產(chǎn)量較高，24h時菌體干重達(dá)3.74g/L。在流加NH3·H2O，控制pH6.0條件下，對菌體補料發(fā)酵進(jìn)行了研究。采用30g/L為初始乳清濃度，發(fā)酵16h以1.0mL/min恒速補料，發(fā)酵44h，菌體干重達(dá)4.79g/L，此時測定發(fā)酵液中活菌數(shù)為1.95×1011CFU/mL。

干酪乳桿菌，高密度培養(yǎng)，補料，乳清

濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑具有發(fā)酵活力強，簡化生產(chǎn)工藝，防止菌種退化和污染，有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定等特點，已廣泛應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵食品的生產(chǎn)。濃縮型發(fā)酵劑的制備需使乳酸菌達(dá)到高密度培養(yǎng)（high cell density culture，HCDC）。乳酸菌的高密度培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基［1-4］和乳基質(zhì)培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基成分復(fù)雜、配制繁瑣，工業(yè)中生產(chǎn)乳品發(fā)酵劑多選用乳基質(zhì)培養(yǎng)基，如全脂奶或脫脂乳粉培養(yǎng)基。乳清是工業(yè)生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)品，主要含有乳糖和乳清蛋白等營養(yǎng)成分，適合乳酸菌生長，是工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵菌劑較理想的原料［5-7］。本文在前期工作優(yōu)化乳清增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在5L發(fā)酵罐上，研究了pH控制和補料條件下干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102）的高密度培養(yǎng)，為進(jìn)一步放大實驗和工業(yè)化生產(chǎn)乳酸菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102） 由韓山師范學(xué)院生物系食品發(fā)酵研究所保藏；MRS培養(yǎng)基［8］用于種子液和發(fā)酵培養(yǎng)；脫脂牛乳培養(yǎng)基10%脫脂乳粉溶于蒸餾水中，108℃滅菌15min，用于活化菌種；乳清培養(yǎng)基 乳清60g/L、牛肉膏8.44g/L、酵母粉8.85g/L、磷酸氫二鉀3.48g/L，pH7.0，用于發(fā)酵培養(yǎng)；D90脫鹽乳清粉 為荷蘭進(jìn)口（乳糖含量82%）；酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏 購自廣州環(huán)凱公司；其他試劑 均為分析純。

2-16離心機 SIGMA；UV-2100分光光度計UNICO；PHS-3B型精密pH計 上海精密儀器設(shè)備公司；5BG 5L全自動發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌種活化：取L.casei STL3102保藏菌種接種于脫脂牛乳培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)至凝乳，鏡檢合格后備用。種子培養(yǎng)：接種1～2環(huán)活化菌種于MRS培養(yǎng)基，250mL三角瓶裝液量50mL，35℃培養(yǎng)16h。發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以7%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。5L發(fā)酵罐中裝液量為2.5L，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，控制罐溫35℃，不通風(fēng)厭氧發(fā)酵，通過自動流加堿液溶液控制發(fā)酵液的pH，通過蠕動泵采用恒速流加方式補料，補料液組成為乳清100g/L、牛肉膏8.44g/L、酵母粉8.85g/L、磷酸氫二鉀3.48g/L。

1.2.2 測定方法 菌體干重的測定：100mL的發(fā)酵液8000×g離心15min，收集菌體沉淀懸浮于10mL蒸餾水中洗滌，再次離心，-20℃預(yù)凍后，冷凍干燥至恒重，稱重。

殘?zhí)菧y定：5mL的發(fā)酵液8000×g離心15min，取上清液適當(dāng)稀釋后，采用鄰甲基苯胺法［9］測定乳糖含量。

滴定酸度測定：取5mL發(fā)酵上清液，參照GB/T 5009.46-2003方法測定滴定酸度（°T）。

活菌數(shù)測定：平板菌落計數(shù)法。菌液10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度吸取1mL于無菌平皿中，然后倒入預(yù)冷至45℃以下的MRS固體培養(yǎng)基，混勻。35℃培養(yǎng)48h，菌落計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

L.casei STL3102在5L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)過程曲線如圖1所示，0～4h為遲滯期，此時菌體量無明顯增加。4～22h為對數(shù)生長期，菌體干重迅速上升，菌體大量產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH迅速下降以及滴定酸度的增加。22h后進(jìn)入穩(wěn)定期。菌體干重在 22h達(dá)到最大1.79g/L，此時乳糖處于較高的濃度30.12g/L，pH為4.21，說明菌體生長停滯不是由于營養(yǎng)物的缺乏造成，而是菌體生長大量產(chǎn)酸抑制引起。

圖1 L.casei STL3102在5L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)過程曲線

2.2 pH控制培養(yǎng)L.casei STL3102

2.2.1 不同pH控制條件對L.casei STL3102增殖的影響 根據(jù)分批培養(yǎng)的結(jié)果，補堿中和乳酸，降低產(chǎn)酸抑制，流加5mol/L NaOH溶液控制發(fā)酵液的pH，考察不同pH控制條件下菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化。結(jié)果（圖2A）表明，加堿控制pH后，減弱了產(chǎn)酸對菌體生長的抑制，控制pH后的菌體干重均高于空白對照。不同pH的實驗組中，控制pH6.0時，菌體生長情況最好，培養(yǎng)22h時菌體干重達(dá)3.29g/L，比分批培養(yǎng)（1.79g/L）提高了83.80%。圖2B顯示，在不同pH控制條件下菌體消耗葡萄糖的趨勢基本相同，pH為6.0時乳糖消耗快，與此條件下菌體生長旺盛相對應(yīng)，22h時菌體干重達(dá)最大時殘?zhí)菨舛葹?1.57g/L。

圖2 控制不同pH條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

2.2.2 不同堿液對L.casei STL3102增殖的影響 控制pH為6.0，考察流加不同堿液對菌體干重和乳糖消耗的影響，結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)10h，不同堿對菌體生長影響差異不顯著。隨著培養(yǎng)時間增加，產(chǎn)酸不斷增加，不同堿液對菌體生長影響出現(xiàn)差異，14～20h，流加NaOH對菌體生長較好，24～28h，流加NH3·H2O組菌體干重顯著高于其余各組。24h時流加 NH3·H2O菌體干重達(dá)到最大 3.74g/L，而Na2CO3、KOH和NaOH的效果較接近。從不同堿液對乳糖消耗的影響圖可以看到，24h獲得最大菌體量時，流加NH3·H2O的殘余糖濃度（24.30g/L）高于其他堿液，說明其單位碳源菌體量得率較高。NH3· H2O不僅可以維持發(fā)酵液pH，而且可以作為氮源被菌體利用，這可能是NH3·H2O優(yōu)于其他堿液的原因。通過使用28%NH3·H2O為中和劑，pH控制為6.0，培養(yǎng)24h時菌體干重達(dá)3.74g/L，比分批培養(yǎng)（1.79g/L）提高了108.9%。

圖3 不同堿液對菌體生長和乳糖消耗的影響

2.3 補料培養(yǎng)L.casei STL3102

由2.2中表明，采用流加NH3·H2O控制pH能夠提高菌體濃度，實驗中發(fā)現(xiàn)，菌體量達(dá)到最大時（24h），發(fā)酵液中殘余乳糖的濃度較高（24.30g/L）。此時由于產(chǎn)酸的影響，菌體生長基本停滯，殘余的乳糖無法被菌體利用造成原料的浪費。因此，可考慮采用較低初始乳清濃度發(fā)酵，中間補加營養(yǎng)物質(zhì)，以提高原料的利用率。

2.3.1 不同初始乳清濃度對菌體增殖的影響 圖4顯示了采用NH3·H2O控制pH6.0時，不同初始乳清濃度條件下菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化。結(jié)果表明，16h內(nèi)30g/L初始乳清濃度菌體生長優(yōu)于45g/L乳清，45g/L乳清濃度能使菌體在較長的時間保持生長并最終獲得較多生物量。較低的初始乳清濃度有利于菌體更快地適應(yīng)環(huán)境，能較快地達(dá)到最大菌體量。以30g/L初始乳清濃度的培養(yǎng)過程，對數(shù)生長末期16h時菌體量達(dá)到最大（2.62g/L），此時殘余乳糖濃度較少（9.14g/L），16h后菌體的生長明顯變緩，低殘?zhí)菨舛葘z的生長產(chǎn)生限制作用。因此，通過設(shè)計中間補料的策略，維持發(fā)酵液中的糖的濃度，促進(jìn)菌體保持較快生長。

圖4 不同初始乳清濃度條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

2.3.2 不同補料速率對菌體增殖的影響 采用30g/L初始乳清濃度，流加NH3·H2O控制pH為6.0，發(fā)酵至16h時分別以0.5、1.0、1.5mL/min恒速補料，測定菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵16h時補料，維持發(fā)酵液中較高的乳糖濃度，使菌體延續(xù)較快地生長，隨著補料的進(jìn)行，發(fā)酵液體積增加，在補料后期菌體濃度有所下降。與不補料相比，補料培養(yǎng)后菌體的生長時間延長，使菌體的最大干重增加。從不同補料速率的結(jié)果對比看，1mL/min補料速率較好，發(fā)酵 44h，菌體干重達(dá)4.79g/L，比分批培養(yǎng)（1.79g/L）和流加NH3·H2O控制pH培養(yǎng)（3.74g/L）分別提高了167.6%和28.07%，此時測定發(fā)酵液中活菌數(shù)為1.95×1011CFU/mL。從乳糖消耗變化過程（圖5B）可以看出，0.5mL/min補料后殘?zhí)侵饾u下降，說明補加乳糖量小于菌體消耗的乳糖，而以1.5mL/min補料前期乳糖先升后降，此時菌體生長較快，而后期補料量的增加使乳糖濃度持續(xù)增加，此時由于發(fā)酵液體積增加的稀釋作用使菌濃度下降。采用補料培養(yǎng)的方法，可以有效地增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度，從而提高了發(fā)酵液中菌體濃度和原料的利用率。

圖5 不同補料速率條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

3 結(jié)論

利用乳清粉為主要原料，在5L發(fā)酵罐上對Lactobacillus casei STL3102的pH控制和補料高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，加堿控制pH對菌體生長有利，控制pH后的菌體干重均高于空白對照，其中控制pH為6.0效果較好。流加不同堿液對菌體干重的積累存在差異，流加NH3·H2O菌體的產(chǎn)量最高，24h時菌體干重達(dá)3.74g/L。對補料高密度培養(yǎng)菌體進(jìn)行了初步研究，采用30g/L為初始乳清濃度，流加NH3·H2O控制pH為6.0，發(fā)酵16h以1.0mL/min恒速補料，發(fā)酵44h，菌體干重達(dá)4.79g/L，比分批培養(yǎng)（1.79g/L）和流加NH3·H2O控制pH6.0培養(yǎng)（3.74g/L）分別提高了167.6%和28.07%，此時測定發(fā)酵液中活菌數(shù)為1.95×1011CFU/mL。

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High cell density cultivation of Lactobacillus casei in whey based medium

LI Yun，HUANG Zhi-dan，ZHENG Li-fen，PENG Zhi-peng，YE Xiao-jing
（Food&Fermentation Engineering Institute of the Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China）

Lactobacillus casei STL3102 was cultivated with high cell density in whey based medium for producing concentrated fermentation starter.The conditions of pH control and fed-batch were investigated.Adding alkali was advantageous to obtain high yield of dry cell weight，and its dry cell weight reached the highest yield when pH was controlled at 6.0.Adding different alkali had significant effect on cell growth，the higher cell yield of 3.74g/L was obtained at 24h with adding NH3·H2O.The fed-batch fermentation of Lactobacillus casei STL3102 was investigated under adding NH3·H2O to control pH at 6.0.When using 30g/L initial whey and feeding at the rate of 1.0mL/min after 16h，the dry cell yield reached 4.79g/L at fermentation time 44h，and then the viable count reached 1.95×1011CFU/mL.

Lactobacillus casei；high cell density cultivation；fed-batch；whey

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0179-03

2009-11-30

李云（1977-），男，講師，碩士，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)和發(fā)酵工程。

韓山師范學(xué)院青年基金資助。