應(yīng)用新型調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(Imaging-PAM)原位評估底泥毒性的方法*

虞 龍 苗秀珍 于 洋 張 民 陽 振 葉琳琳 孔繁翔

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京，210009;2.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京，210008)

應(yīng)用新型調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(Imaging-PAM)原位評估底泥毒性的方法*

虞 龍1＊＊苗秀珍1于 洋2張 民2陽 振2葉琳琳2孔繁翔2

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京，210009;2.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京，210008)

應(yīng)用新型調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)Imaging－PAM，通過最大葉綠素?zé)晒饬孔赢a(chǎn)量(Fv/Fm)、實際熒光量子產(chǎn)量(YⅡ)指標(biāo)的測定原位評估了友誼河底泥對斜生柵藻(Scenedesmus obliqnus)的毒性效應(yīng).數(shù)據(jù)顯示，在友誼河底泥懸浮液中，柵藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈現(xiàn)出時間－效應(yīng)型曲線，72h時Fv/Fm和YⅡ分別下降至對照的44%和35%，F(xiàn)v/Fm和YⅡ的半抑制時間分別為57h和45h.同時，通過對友誼河底泥樣品中重金屬含量的檢測，計算地積累指數(shù)(Igeo)，得出友誼河底泥中的Hg、Zn和Cu分別為嚴(yán)重污染，重污染和偏重污染水平，這可能是影響藻類光合作用的主要污染物.本研究為進行底泥毒性評估提供了新的原位分析方法.

斜生柵藻，底泥毒性，葉綠素?zé)晒饬孔赢a(chǎn)量，Imaging－PAM.

目前，沉積物生物評估進展緩慢，其原因主要是由于檢測手段的限制，很難將測試種群(如藻類、細菌)與沉積物顆粒有效區(qū)分并進行生理生化水平的檢測.而使用沉積物浸出液的傳統(tǒng)方法又不可避免地會出現(xiàn)氧化還原、金屬形態(tài)的變化、膠體的破壞等諸多問題，與真實環(huán)境差異較大.新型調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(Imaging－PAM)是結(jié)合Microscopy版探頭與特制熒光顯微鏡的一種在線葉綠素?zé)晒夥治鱿到y(tǒng)，可以探測和研究植物光合生理狀況及各種外界因子對其細微影響.此技術(shù)具有功能強大，操作極其簡單快速，對受測試的藻體無損傷以及測量結(jié)果在屏幕上可見的優(yōu)點，不僅如此還可以對底泥進行原位的生物分析，已經(jīng)在水生生物和高等植物上有所應(yīng)用［1－2］.2004年Ralph等人用它來研究海草的動力學(xué)［3］，2005年P(guān)odola等人以微藻做指示生物，以調(diào)制葉綠素?zé)晒鉃橹笜?biāo)，結(jié)合熒光成像技術(shù)批次檢測揮發(fā)性有機污染物［4］.在國內(nèi)Imaging－PAM主要用于考察玉米、冬小麥、麻楓樹、木蘭植物、三裂葉蟛蜞菊等逆境脅迫下高等植物葉綠素?zé)晒獾淖兓?－9］.林阿朋等運用Microscopy－Imaging－PAM對青島海域漂浮和沉降滸苔進行光合作用研究［10］.

本文應(yīng)用Imaging－PAM技術(shù)，通過顯微鏡成像系統(tǒng)對底泥顆粒和柵藻細胞進行區(qū)分，根據(jù)柵藻細胞光合作用變化原位評估底泥毒性，為水污染控制提供參考.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

斜生柵藻(Scenedesmus obliqnus)采用BG11培養(yǎng)基，在250ml的三角瓶中加入100ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度(26±1)℃，光照強度為(30±10)μmol·m－2·s－1，光暗比為12∶12，靜置培養(yǎng)，每天早晚定時振蕩兩次.

1.2 底泥的采集與處理

2009年5月在南京選擇重金屬污染較嚴(yán)重友誼河－友誼橋附近采集底泥樣品，并以玄武湖東南湖灣較為干凈的底泥作為對照.使用底泥采樣器采集沉積物上層0—3cm深處100g泥樣，手工挑除石子，貝殼等雜質(zhì).為減少采樣誤差，每個采樣點附近分別采集底泥樣3個，混合后分別密封于無毒聚氯乙烯袋或桶中，帶回實驗室4℃保存.

把采集來的底泥冷凍干燥后，稍加研磨后用250目篩過濾后得淤泥和沙，將泥沙比例固定在1∶9得到最終泥樣.經(jīng)預(yù)實驗，沉積物濃度優(yōu)化以10%濃度為最佳，即9ml的水(經(jīng)0.45μm膜過濾)中加入1g泥樣.取3支30ml的聚碳酸酯管分別加入最終泥樣1g，分別向各樣品管輕輕加入9ml的水(經(jīng)0.45μm膜)過濾.

1.3 實驗方法

無菌條件下取對數(shù)生長期的斜生柵藻藻液適量用蒸餾水沖洗和離心(4000r·min－1，5min)3次后接入樣品管，使初始藻細胞的密度為(5—9)×105個 cell·ml－1，于3h，12h，24h，36h，48 h和72h 脅迫培養(yǎng).光照強度為(30±10)μmol·m－2·s－1，溫度為(26±1)℃，光暗比為12∶12.

利用調(diào)制熒光成像系統(tǒng)Imaging－PAM(Walz，Germany)測定PSII的最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)以及實際量子產(chǎn)率－YⅡ.分別在0 h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后取不同處理組的藻培養(yǎng)液10μl于載玻片上進行測定，每處理取3個平行，每個平行5個視野，每個視野隨機選擇15—20個藻細胞圈定見圖1，取其熒光動力學(xué)參數(shù)的平均值，測定之前樣品至少暗適應(yīng)15 min，所有操作均在背景光強低于1μmol·m－2·s－1的環(huán)境中進行.儀器的作用光強度均設(shè)為默認值80 μmol·m－2·s－1，測量光低于0.5 μmol·m－2·s－1，增益設(shè)置為9.暗適應(yīng)后的最大光合效率Fv/Fm，光適應(yīng)下的實際效率YⅡ的計算按文獻公式由儀器自動給出［11］.

圖1 底泥懸浮液中柵藻細胞的熒光圖像(200倍放大)Fig.1 The fluorescence image of Scenedesmus obliquus cells in sediment suspension(amplification of 200)

1.4 重金屬離子的測定

取底泥樣品2—3g為佳.瑪瑙研缽粉碎至≤200目，存放于紙質(zhì)樣品袋中，105℃以下烘干.鹽酸硝酸氫氟酸高氯酸敞開消解.用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP－AES)檢測出6個對柵藻生長敏感的重金屬元素(Co，Cu，Mn，Ni，Pb，Zn)的數(shù)據(jù)，用來檢測底泥中Hg元素的樣品只需用瑪瑙研缽粉碎至≤100目，在50℃以下烘干用CVAAS方法在直接汞分析儀上測出.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同位點底泥懸浮液中柵藻光合作用指標(biāo)的變化

柵藻在污染底泥中脅迫0h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后Fv/Fm的變化見圖2，F(xiàn)v/Fm在3h時下降為對照組的72%，在12h上升與對照相當(dāng)，在12h后又開始下降，在24h，48h，72h時分別為對照的73%，57%，44%.在72h時其值為0.29.

柵藻在污染底泥中脅迫0 h，3h，24h，36h，48 h和72h后在第一個飽和脈沖條件下的YⅡ(Yi)值的變化見圖2.YⅡ在3h時快速的下降，為對照組的63%，在12h上升為對照的76%，在12h后又開始下降，在72h時其值為0.23，是對照的35%.

本實驗除了以量子產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，也應(yīng)用了快速光響應(yīng)技術(shù)，在不同處理時間的底泥懸浮溶液中測定柵藻細胞的相對電子傳遞速率(rETR)的快速光響應(yīng)曲線見圖3.各處理組的rETR值隨光照強度的增加呈逐漸增加趨勢;在12h時柵藻細胞的rETR光響應(yīng)曲線增加趨勢與對照相當(dāng)，隨著脅迫時間越長，增加趨勢越緩慢，表明隨著脅迫時間的延長，柵藻植株耐光抑制能力顯著降低.

圖2 不同時間底泥懸浮液Fv/Fm與YⅡ的變化Fig.2 Changes of Fv/Fm and YⅡin sediment suspension with exposure time

圖3 不同光強下底泥懸浮液表觀電子傳遞速率(mean±se)的變化Fig.3 Changes of rETR(mean ± se)in sediment suspension under various light intensity

12h后的脅迫時間，無論是Fv/Fm還是YⅡ值都表現(xiàn)出時間－效應(yīng)曲線的變化規(guī)律，可計算出在這一時間段內(nèi)底泥懸浮液中柵藻細胞經(jīng)脅迫后的半抑制時間，柵藻細胞在友誼河底泥懸浮液中連續(xù)暴露72h時間內(nèi)Fv/Fm和YⅡ熒光指標(biāo)的半抑制時間分別為57h和45h.

最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm，即PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率是衡量PSII完整性的指標(biāo).在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)v/Fm是一個很穩(wěn)定的值，藻類約為0.65［12］.當(dāng)藻類受到脅迫時，其值顯著下降［13］.YⅡ則是光系統(tǒng)Ⅱ的有效量子產(chǎn)量，表示植物體光合機構(gòu)將吸收的光能進行轉(zhuǎn)化的能力.而相對電子傳遞速率(rETR)是反映實際光強下吸收的光能沿光合電子傳遞鏈被傳遞利用的多少，可以在相當(dāng)程度上反映植物的光合速率的大小［14－15］.

經(jīng)毒性底泥懸浮液脅迫后的柵藻細胞的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)Fv/Fm，YⅡ和rETR與對照相比在3—12h內(nèi)迅速下降后再顯著升高，其中Fv/Fm和rETR在12h時與對照相當(dāng).三者在12h后又開始降低，在短時間0—3h內(nèi)有可能是沉積物顆粒遮擋了藻細胞而影響藻細胞的光合作用從而抑制其生長，柵藻細胞對于這種泥水混合的環(huán)境一時還難以適應(yīng)，表現(xiàn)為光合作用下降.之后到12h時底泥懸浮液對于柵藻的生長沒有表現(xiàn)毒性反而促進其生長，可能的原因是底泥中毒性物質(zhì)的釋放量還很少呈現(xiàn)為Hormesis現(xiàn)象(毒物興奮效應(yīng))，與Calabreseh和Baldwin的雙相劑量－反應(yīng)模式符合［16］，還有一種可能是由于沉積物會釋放出營養(yǎng)物質(zhì)最初可以促進藻的生長，潛在地遮蔽了污染物的毒性效應(yīng)［17］.隨著脅迫時間的延長，底泥中重金屬離子釋放增加，改變原生質(zhì)膜的滲透性，使K+從細胞內(nèi)喪失，影響藻類的生長和光合作用［18］.在72h時 Fv/Fm 和 YⅡ分別降低到0.29和0.23.Schansker等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v/Fm 值大于0.44時，PSⅡ活性隨著Fv/Fm的降低而降低，當(dāng)小于0.44時就完全失去活性，表現(xiàn)出反應(yīng)中心的破壞，光合效率降低［19］.

2.2 不同位點底泥中地積累指數(shù)與污染程度

考慮到友誼河多年來接納了兩岸的工業(yè)廢水和生活污水，而多種污染物中重金屬離子作用尤為明顯.為了對水質(zhì)污染程度進行大致的評價并與藻類毒性實驗結(jié)果相比較，我們以常用的地積累指數(shù)(Igeo)［20］來對沉積物中重金屬的污染程度進行評價.表1列出了友誼河底泥中主要重金屬含量及重金屬地球化學(xué)背景值(采用中國土壤元素的幾何平均值，mg·kg－1)，以及運用地積累指數(shù)(Igeo)算出的友誼河主要重金屬元素的污染情況.從表1中可以看出，友誼河底泥中Hg，Zn和Cu元素的含量很高，達到重污染的水平.

重金屬離子對于藻類有嚴(yán)重的脅迫作用，能引起藻類生理代謝功能紊亂，減少細胞色素，抑制光合作用致使葉綠素?zé)晒庵底兊?因此柵藻細胞光合作用下降可能主要來源于Hg，Zn和Cu等離子的聯(lián)合作用.這與Mallick和Mohn發(fā)現(xiàn)的斜生柵藻暴露于含Cu，Cr，Ni，Cd，Zn等重金屬的水體中12h后Fv/Fm下降的結(jié)果相一致［21］.

表1 友誼河主要重金屬元素含量及污染情況Table 1 Main heavy metal concentrations and pollution grades in Friendship River sediment

3 結(jié)論

本研究運用調(diào)制熒光成像系統(tǒng)Imaging－PAM檢測污染底泥中柵藻光合作用的變化，得出在重金屬離子為主的底泥污染物作用下，柵藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈現(xiàn)出時間－效應(yīng)型曲線;相對電子傳遞速率(rETR)隨光照強度的增加呈逐漸增加趨勢，隨著脅迫時間越長，增加趨勢緩慢.由此可見，Imaging－PAM作為一種新型的在線葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以原位快捷地應(yīng)用于沉積物污染評估，為環(huán)境風(fēng)險評價進一步接近真實環(huán)境提供一定基礎(chǔ).

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AN IN-SITU ASSESSMENT OF SEDIMENT TOXICITY WITH THE APPLICATION OF IMAGING-PAM

YU Long1MIAO Xiuzhen1YU Yang2ZHANG Min2YANG Zhen2YE Linlin2KONG Fanxiang2
(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing，210009，China;2.Nanjing Institute of Geography＆ Limnology，Chinese Academy of Sciences，State Key Laboratory of Lake Science and Environment，Nanjing，210008，China)

New modulated chlorophyll fluorescence imaging system Imaging－PAM has been applied as an effective detection in short－term bioassays with Scenedesmus obliquus. Maximum quantum yield of chlorophyll fluorescence(Fv/Fm)and the actual fluorescence quantum yield(YⅡ)were used to assess the toxicity of the sediment from Youyi River.Data showed that in 12h exposure there was a rapid increase in Fv/Fm and YⅡof Scenedesmus obliquus in the sediment suspension of Youyi River，whereas after 12h a time－response curve appeared.In 72h the Fv/Fm and YⅡdropped to 44%and 35%of that of the control respectively，the halfinhibition time of Fv/Fm and YⅡwere 57h and 45h.At the same time by detecting the concentration of heavy metals in the sediment of Youyi River，the index of geoaccumulation(Igeo)was accounted as follows:Hg，Zn，and Cu reached serious pollution，heavy pollution and partial heavy pollution levels respectively.They are the probobly the primary contaminants affecting the photosynthesis of algae.This study may provide a new method to assess the toxicity of sediment in situ.

Scenedesmus obliquus，in－situ assessment of sediment toxicity，quantum yield of chlorophyll fluorescence，Imaging－PAM.

2009年12月24日收稿.

*國家自然科學(xué)基金項目(20807043);中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所所長基金(07SL021001)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，Tel:15850560573;E－mail:bilbobaggins@126.com