IPTG誘導變形鏈球菌葡糖基轉移酶可溶性表達及活性初步測定*

汪林 儲冰峰 王成龍 劉洪臣 邵寧生 楊光 董潔 劉玉

IPTG誘導變形鏈球菌葡糖基轉移酶可溶性表達及活性初步測定*

汪林 儲冰峰 王成龍 劉洪臣 邵寧生 楊光 董潔 劉玉

目的：提取變形鏈球菌GS5葡糖基轉移酶GTF(glucosy ltransferase)催化活性區(qū)(CAT)的基因，利用IPTG誘導后獲得可溶性表達，并檢測活性。方法：利用PCR技術克隆CAT的基因片段，通過蛋白重組融合表達技術使其在大腸桿菌BL21中表達，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導含有質(zhì)粒pET32-NusA-CAT的大腸桿菌，SDS－PAGE電泳進行檢測；采用蒽酮硫酸法驗證活性。結果：成功將CAT基因連入大腸桿菌BL21，獲得可溶性的融合蛋白表達；并且融合蛋白具有生物學活性。結論：IPTG成功誘導克隆的變形鏈球菌葡糖基轉移酶催化活性區(qū)基因并獲得可溶性融合蛋白的表達，具有生物學活性。

變形鏈球菌;葡糖基轉移酶;大腸桿菌

葡糖基轉移酶(Glucosy ltransferase，GTF)是變形鏈球菌合成的重要致齲因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在內(nèi)的多種胞外多糖[1]，包含催化活性區(qū)(Cataly tic,CAT)和葡聚糖結合區(qū)(Glucan binding, GB或GLU)兩個功能區(qū)段[2]，催化活性區(qū)具有催化蔗糖水解的活性，能夠催化蔗糖產(chǎn)生葡聚糖[3]。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導劑可與阻遏物結合促進基因的表達，但是IPTG對人體具有潛在的毒性[4]。本實驗擬通過PCR方法獲得CAT區(qū)的基因片段，并將其克隆至原核表達載體pET-32-NusA中，摸索IPTG合適的誘導條件，使大腸桿菌BL21高表達其融合蛋白，為后續(xù)篩選GTF的拮抗劑打下基礎。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及細胞株變形鏈球菌GS5購自首都醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院；大腸桿菌BL21和pET-32a由軍事醫(yī)學科學院基礎所保存。

1.1.2 主要試劑DNA純化回收試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ,H indⅢ均購自TaKaRa公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自法特捷公司；Taq DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶均購自天為時代公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GTF的CAT基因表達載體的構建與鑒定質(zhì)粒pET-32a和PCR產(chǎn)物分別進行H indⅢ和XhoⅠ雙酶切及切膠回收,連接后轉化E. coliBL21。雙酶切pET－32-NusA載體(由軍事醫(yī)學科學院基礎所保存)體系：pET－32-NusA載體3μl，H indⅢ1μl，XhoⅠ1μl，Buffer M 2μl，ddH2O13μl,總體積20μl。挑單克隆提取質(zhì)粒做PCR和雙酶切鑒定。

1.2.2 GTF融合蛋白的誘導表達及表達鑒定將測序鑒定后的重組質(zhì)粒轉化E.coli BL21,挑取單克隆過夜培養(yǎng)。將10μL連接產(chǎn)物加入200μl大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中(體積不超過感受態(tài)體積的5%)，轉入1m lM.S.A培養(yǎng)基，37℃搖床180r/m in培養(yǎng)約45m in。用原先釣取基因時合成的引物進行菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將該克隆測序。

1.2.3 重組GTF的誘導表達將重組菌培養(yǎng)擴增后加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L誘導后進行蛋白電泳檢測。超聲破碎菌體，分別收取上清及沉淀，12%SDS-PAGE電泳。

1.2.4 重組GTF蛋白的可溶性鑒定收集誘導后菌液1m l,冰水浴中超聲處理,之后4℃離心分別收集上清和沉淀,12%SDS-PAGE分析。將獲得的上清液透析凍干并進行Western-Blot鑒定，天然的變形鏈球菌菌液處理方法相同。

1.2.5 重組GTF蛋白的生物活性初步測定采用蒽酮硫酸法對重組GTF蛋白進行生物活性測定，加入不同濃度的蔗糖與重組GTF蛋白孵育后進行OD630數(shù)值讀取。

1.3 統(tǒng)計分析采用spss13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2.結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果以提取的變形鏈球菌GS5基因組DNA為模板，以合成的CAT-C基因上下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行電泳，用H indⅢ,XholⅠ酶對PCR產(chǎn)物進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收。

2.2 pET-32-NusA-CAT表達載體的構建及PCR鑒定將目的片段與表達載體連接后，轉化大腸桿菌BL21挑取單克隆進行菌落PCR鑒定(圖1)。

圖1 重組菌菌落PCR鑒定

2.3 PCR產(chǎn)物測序結果及同源性分析結果顯示所得到的序列與已公布的序列的同源性為98%。所得序列與網(wǎng)上公布序列比對結果：Score= 2054 bits(1068),Expect=0.0 Identities= 1108/1128(98%),Gaps=0/1128(0%)Strand= Plus/Plus。

2.4 重組GTF的誘導表達重組GTF在上清中表達量明顯高于在沉淀中的表達，說明重組GTF是可溶性蛋白。

圖2 重組GTF的誘導表達

2.5 W esrtern-blot結果將含有重組GTF的菌超聲碎菌后上清透析凍干，與多抗抗體發(fā)生反應天然的變形鏈球菌同法處理，結果見圖3。

圖3 W esrtern-blot結果A：重組GTF B：天然菌中提取GTF

2.6 蒽酮硫酸法初步測定重組GTF生物學活性隨著參與反應的蔗糖濃度從糖濃度1到糖濃度3降低，OD630數(shù)值隨之降低，見圖4。

圖4 蒽酮硫酸法初步測定重組GTF生物學活性經(jīng)過統(tǒng)計學t檢驗P＜0.05證實有統(tǒng)計學差異

3.討論

在變形鏈球菌中，水解蔗糖并催化合成葡聚糖的葡萄糖基轉移酶(GTF)已被廣大學者公認為重要的致齲因子之一[5]，由它產(chǎn)生的水不溶性葡聚糖能夠促進細菌與牙表面及細菌之間的粘附，從而形成菌斑。GTF在不同血清型的變形鏈球菌中有著不同的種類，在C型中主要分為三種，分別是：GTF－I，GTF－S，GTF－SI，分別對應著基因gtfB，gtfD和gtfC[6,7]。GTF－I催化合成水不溶性葡聚糖(W IG)，GTF－S合成水溶性葡聚糖(WSG)，GTF－SI合成水不溶性和水溶性葡聚糖的混合物，其中gtfC編碼的GTF-SI對致齲尤為重要[8]。Hanada和Kuram itsu等[6]已經(jīng)在體外實驗中證實，變形鏈球菌GS5gtfC基因缺失的突變體喪失了在光滑牙面的蔗糖依附性。

由于GTF種類比較多,并且在變形鏈球菌細胞胞漿內(nèi)、細胞壁上以及細胞間質(zhì)中均有分布,因此想獲得GTF的步驟也比較紛繁復雜。一般采用硫酸銨鹽析法即對細胞裂解物或發(fā)酵液進行沉淀,然后再用各種層析方法主要是羥磷灰石填充柱和PBE94聚焦色譜柱進行，但是此方法步驟多,酶量和酶活性損失大；親和層析法即通過GTF與葡聚糖或右旋糖苷結合特異的親和性來富集、分離和純化各種GTF[9]。在1999年Jespersgaard等[10]用Sephadex G-100和Sephadex G-150層析柱進行親和層析發(fā)酵液,洗脫,而得到富集GTF的組分。Yamashita等[11]依次利用DEAE-纖維素離子交換層析、右旋糖苷瓊脂親和(dex tran-agarose affinity)層析、TSK-gel Phey l-5PW高效液相(high performance liquidch romatography,HPLC)法分離純化了GTF-SI、GTF-I、GTF-S等組分。相對于傳統(tǒng)的層析方法來說,親和層析特異性強,濃縮效率高并且反應條件溫和,酶活性不易損失,純化步驟也大大簡化,但要得到大量的單一的GTF組分還是比較困難的。因此很多學者也嘗試用基因工程的方法來表達其編碼基因并獲得純的GTF[12,13]。

Hanada等(1988)研究表明，gtfC基因緊靠gtfB基因下游，與gtfB有高度同源性。用Southern印跡法分析證實多數(shù)同源基因含有7.3kb的Pst I片段，也由3個ORF組成。gtfC序列中A+T含量高達78%。GTF-SI蛋白質(zhì)由1375個氨基酸殘基組成，該序列中也同gtfB一樣幾乎不含半胱氨酸。GTF-SI整體呈親水性，但在信號序列、一段肽內(nèi)序列和3'端約50個氨基酸殘基這3個區(qū)段呈疏水性[6]。

GTF中的催化活性區(qū)(CAT)是它的重要功能區(qū)段，具有催化蔗糖水解的活性。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在探索了誘導物濃度對蛋白質(zhì)表達量的影響后發(fā)現(xiàn)并不是IPTG誘導物濃度越大蛋白質(zhì)表達量越多，在IPTG誘導重組GTF可溶性表達中，我們反復摸索條件，后來發(fā)現(xiàn)IPTG在終濃度為0.1mmol/L、誘導溫度為30℃是上清中重組GTF含量最高，即能大量獲得可溶性的重組GTF。由此我們在后續(xù)實驗中可以簡便高效的獲得目的蛋白，通過蒽酮硫酸法進行活性檢測。在實驗中采用蒽酮硫酸法只是對重組GTF的生物學活性進行初步測定，在后續(xù)實驗中還將進一步驗證。本實驗的目的在于利用IPTG誘導后完成GTF中催化活性區(qū)(CAT)在大腸桿菌BL21上的可溶性的表達，并對于重組GTF進行了生物活性初步測定，為后續(xù)實驗打下基礎。

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全國口腔頜面-頭頸腫瘤綜合序列治療學術研討會暨口腔頜面－頭頸腫瘤綜合治療高級研修班第一輪會議通知

由中華口腔醫(yī)學會口腔頜面外科專業(yè)委員會批準，口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科協(xié)作組主辦、解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學中心承辦的“第五次全國口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科學術會議”暨“國家級繼續(xù)教育項目[項目編號：2010-08-02-020(國)]——口腔頜面頭頸腫瘤的綜合治療高級研修班”將于2010年10月14日至17日將在北京舉行，會議地點設在解放軍總醫(yī)院。屆時將邀請口腔頜面外科專業(yè)委員會名譽主任委員、中國工程院院士邱蔚六教授、華西口腔醫(yī)院王大章教授、第四軍醫(yī)大學劉寶林教授等知名專家將到會。參會人員將獲得I類繼續(xù)教育10學分。

1.征文內(nèi)容：口腔頜面-頭頸腫瘤的化療、放療、生物治療、熱療、冷凍等綜合治療的相關臨床治療新方法、經(jīng)驗總結以及基礎研究的新技術、新進展。

2.稿件要求：來稿請寄中文題目、作者單位和作者姓名，500字以內(nèi)四段式結構中文摘要(包括目的、方法、結果和結論)各一份。請詳細注明通訊地址、郵政編碼和聯(lián)系電話。

3.截稿日期：2010年9月20日(郵戳為準)。

4.會務費：每人1000元(包括工作午餐、講義等)，統(tǒng)一安排食宿，交通、住宿費自理。

5.會議地址：北京解放軍總醫(yī)院

6.聯(lián)系方式：上海市制造局路639號，上海第九人民醫(yī)院口腔頜面外科郵編200011聯(lián)系人：任國欣電話：021-50398070 E-mail：renguoxincn@hotmail.com北京市海淀區(qū)復興路28號，解放軍總醫(yī)院口腔外科一病區(qū)郵編100853聯(lián)系人：席慶電話：13552706909 E-mail：xqsg@sina.com.cn

全國口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科協(xié)作組

解放軍總醫(yī)院

IPTG induction of the soluble catalytic region of S.mutansexpression and activity assay

WANG Lin,CHU Bing-feng,WANG Cheng-long,LIU Hong-chen,SHAO Ning-sheng,YANG Guang,DONG Jie,LIU Yu.（Institute ofStomatology,GeneralHospitalofChinese PLA,Beijing 100853,China）

Objective:To clone the catalytic region of Glucosyltransferase from StreptococcusmutansGS5 and express it in Escherichia coliBL21 by IPTG induction,obtain the soluble rGTFand activity assay.M ethod:PCR and construction of fusion protein technique,IPTG induction,anthrone-sulfuric acid assay.Result:The CAT genewascloned correctly and its fusion protein was expressed in E.coli by IPTG induction.The SDS-PAGE results showed that the rGTF is soluble,and anthrone-sulfuric acid assay demonstrated itsbiologicalactivity.Conclusion:The aimed gene and its fusion proteinwere gained successfully,and to be demonstrated itsbiologicalactivitywhich providesa base to the further research.

S.mutans;Glucosyltransferase;Escherichia coli

R780.1

A

1672-2973(2010)02-0094-04

2009-12-10)

國家自然科學基金資助項目(編號30440059)

汪林解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學研究所博士生北京100853

儲冰峰解放軍總醫(yī)院老年口腔病科主任醫(yī)師北京100853

王成龍解放軍總醫(yī)院口腔內(nèi)科副主任醫(yī)師北京100853

劉洪臣通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學研究所所長主任醫(yī)師教授北京100853

邵寧生軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所研究員北京100850

楊光軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所副研究員北京100850

董潔軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所助理研究員北京100850

劉玉軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所博士生北京100850