血管內皮生長因子對小型豬腮腺放射性損傷影響的實驗研究*

霍文艷 顏 興 郝龍英 韓培彥

頭頸部惡性腫瘤患者大部分要接受放射治療[1]。但放射線對正常涎腺組織也造成一定程度的損害。目前研究證實唾液分泌減少與腺泡細胞正常結構和血管內皮細胞損傷、微血管密度減低有關[2-4]。因此在放射治療過程中保護血管內皮細胞，減少涎腺微血管密度降低幅度是可能的治療方向之一。已有研究證實VEGF能促進上皮細胞增殖，提高毛細血管密度[5，6]。并且VEGF不論對發(fā)育過程中還是放射性損傷中的微血管均有生發(fā)功能[7]。本研究旨在探討放療前腮腺局部注射VEGF對放療后腮腺微血管密度的影響。

1.材料和方法

1.1 實驗動物 采用健康雄性6-10個月大五指山雜交小型豬9只，體重50-55公斤，由中國農業(yè)大學動物實驗中心提供，由首都醫(yī)科大學實驗動物中心喂養(yǎng)，實驗前環(huán)境適應至少兩周，隨機分為3組：空白對照組、單純放療組、VEGF+放療組。

1.2 給藥方法 采用聯(lián)合麻醉，肌注氯胺酮(6mg/kg)，速眠新(0.6mg/kg)麻醉后，將小型豬仰臥，每側耳后肌注1.5mg硫酸阿托品。開口器撐開動物口裂，將帶芯軟管伸入小型豬腮腺導管。VEGF+放療組給予VEGF處理：采用雙側腮腺導管逆行注射法給藥，濃度為0.25ug/ml，每一小時給藥2ml，共兩次，總計量4ml(1μg)。單純放療組及空白對照組同時給予雙側腮腺導管逆行注射4ml生理鹽水。

1.3 小型豬放療損傷建立 給藥11天實驗給藥組及對照放療組小型豬實施放療，體位為俯臥位，麻醉后固定，放射線從豬的后背側單后野垂直照射一側腮腺組織，實驗組及對照組小型豬均給予20Gy雙側腮腺投照。照射源采用電子直線加速器(美國瓦里安公司Clinac 600C)，射線平均能量6mv，劑量率3.2Gy/min。照射野10cm×12cm，照射距離100cm。標準對照組麻醉后給予0Gy射線。

1.4 腮腺組織樣本采集及免疫組織化學染色 放射治療4小時麻醉固定動物后，分別取雙側腮腺上方、中方、下方標本，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，并行3um厚連續(xù)切片，采用SP二步法，切片經常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，抗原熱修復，兔抗豬VEGF單克隆抗體標記 VEGF；羊抗豬 CD31、兔抗人AQP1單克隆抗體標記腮腺微脈管，使用山羊超敏二部法、兔二部法檢測試劑盒檢測，DAB顯色，蘇木素復染，光鏡觀察。

1.5 結果判斷 微血管密度檢測：高倍鏡(200×)視野下隨機計數(shù)20個視野的免疫組化染色陽性細胞數(shù)，并取其平均值作為該例微血管數(shù)目。以鏡下胞質內有棕黃色顆粒為血管內皮細胞陽性判斷標準。單個或成叢的內皮細胞，不管成腔與否均視為單個微血管，凡管徑大于3mm血管(即200×鏡下15um)不予計數(shù)(圖1)。

圖1 腮腺微血管與大血管比較(×200)

1.6 統(tǒng)計學方法 計量數(shù)據(jù)用表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Newman-Keuls方法。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。用SPSS10.0完成統(tǒng)計工作。

2.結果

2.1 VEGF染色結果觀察 VEGF免疫組化染色切片在100倍及200倍顯微鏡下觀察：VEGF+放療組在逆行注射11天時腺體導管細胞有大量VEGF表達，在腺泡細胞內也有大量VEGF表達，而空白對照組和單純放療組僅導管細胞內有VEGF表達，腺泡細胞內缺乏VEGF表達(圖2)。

圖2 A空白對照組,B單純放療組,C VEGF+放療組VEGF免疫組化(×100)

2.2 HE染色結果觀察：HE染色結果100倍光鏡下觀察顯示空白對照組、VEGF+放療組、單純放療組之間腮腺組織學結構無明顯差異。(圖3)

2.3 免疫組化染色結果觀察

2.3.1 CD31染色陽性計數(shù)比較 (圖4)CD31染色陽性計數(shù)比較：空白對照組、VEGF+放療組及單純放療組腮腺CD31陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異(F=47.727，P＜0.05)。且均數(shù)兩兩之間的差異具有統(tǒng)計學意義(表1)。

圖3 空白對照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微組織結構(HE)(×100)

圖4 空白對照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微血管密度(免疫組化CD31染色)(×100)

表1 空白對照組，VEGF+放療組和放療組腮腺CD31的比較()

表1 空白對照組，VEGF+放療組和放療組腮腺CD31的比較()

注：*P＜0.05 vs空白對照組，#P＜0.05 vs VEGF+放療組

2.3.2 AQP1染色陽性計數(shù)比較 (圖5)AQP1染色陽性計數(shù)比較：空白對照組、VEGF+放療組及單純放療組腮腺AQP1陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異(F=18.707，P＜0.05)?？瞻讓φ战M與VEGF+放療組、單純放療組AQP1比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但VEGF+放療組與單純放療組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表2)。

圖5 空白對照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微血管密度(免疫組化AQP1染色)(×100)

表2 空白對照組、VEGF+放療組、單純放療組腮腺AQP1的比較()

表2 空白對照組、VEGF+放療組、單純放療組腮腺AQP1的比較()

注：*P＜0.05 vs空白對照組，#P＞0.05 vs VEGF+放療組

3.討論

在腮腺放射性損傷機制的研究中，腺泡細胞的損傷和腮腺微血管的改變被認為是放射性損傷的關鍵因素。目前研究中，保護微血管內皮細胞是防止射線損傷的主要目標之一。涎腺放射性損傷中，腺體實質損傷的同時涎腺微血管密度明顯下降。Cotrim[2]等研究VEGF對小鼠涎腺血管內皮細胞的保護作用，將腺病毒介導的VEGF載體投遞入涎腺組織，放療后涎腺微血管密度較對照組有明顯提高。由于基因治療目前尚有轉導機制未完全清楚、載體安全性等理論問題，所以還較難向臨床推廣使用。VEGF是目前研究較為成熟的細胞因子之一，本研究旨在探討應用臨床常用的腮腺導管逆行注入給藥方式，VEGF對腮腺放射損傷的保護意義。以往對預防涎腺放射損傷的研究主要是在小鼠上得到證實，如果應用于臨床則需要在更接近人類生物學性能的大型動物上進行實驗。張昕等在比較四種動物與人類的涎腺差異后發(fā)現(xiàn)：在重量、大小及造影表現(xiàn)上，小型豬涎腺較嚙齒類動物更接近于人類[8]。本研究選用小型豬腮腺為研究模型更接近臨床應用。

在對小型豬腮腺損傷的動物模型研究中，多采用單次照射研究。當放射劑量達到15Gy時腮腺唾液流率表現(xiàn)下降，高于25Gy腮腺將發(fā)生永久的不可逆的結構破壞[9]，涎腺功能難以恢復[10，11]。相對于臨床應用的分割劑量照射，本實驗照射劑量為單次20Gy，相當于分次照射43次，每次2Gy，與臨床常規(guī)應用的放射劑量接近。有研究表明涎腺的放射性損傷的組織學改變于腺體接受射線的早期即可發(fā)生，光鏡下觀察腮腺放療后2小時即可見到腺泡不同程度的組織學改變[12]。腺體微血管密度的研究則發(fā)現(xiàn)大量的唾液腺微血管密度喪失發(fā)生于放療后4小時，即唾液腺微血管密度減低45%。本研究目的主要在于觀察VEGF對腮腺放射后早期損傷及腺體微血管密度的影響，即選擇放射后腺體微血管密度下降最為明顯4小時為觀察點。VEGF可促進局部組織新生血管形成已得到證實，其促血管生成方式有3種：血管新生、動脈生成、血管發(fā)生。血管新生指在原先存在的毛細血管內皮細胞基礎上通過出芽方式萌生新的毛細血管，即毛細血管芽生。血管發(fā)生曾一直被認為僅限于胚胎發(fā)育期，直到最近，人們才接受出生后血管發(fā)生的存在。動脈生成是指側支微動脈的成熟或新生過程，經內皮細胞增殖和血管重塑形成管徑和面積更大的，血管造影可見的動脈。上述的三個過程中，都有VEGF的參與。VEGF依據(jù)其濃度不同發(fā)揮作用也不同，低濃度時血管新生占優(yōu)勢，高濃度時血管發(fā)生占優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)在正常腮腺組織中VEGF僅在導管細胞內表達，而在腺泡細胞內缺乏表達。探討應用導管逆行注射法將外源性VEGF導入腮腺腺泡細胞的可行性，研究結果顯示注射后導管細胞與腺泡細胞內均有外源性VEGF表達，證明該方法是提高放射區(qū)腮腺組織中VEGF水平的有效手段。研究外源性VEGF對自體組織血管再生時間效應時發(fā)現(xiàn)[13]：應用VEGF后1-7天組織結構特征沒有明顯改變；7-14天后可見自體組織微血管再生呈明顯趨勢，組織學表現(xiàn)為新生組織和微血管數(shù)量明顯增多。本研究中于放療前11天采用雙側腮腺導管逆行注射法給予VEGF，目的是保證VEGF促微血管形成的高峰期與腮腺放射后微血管密度的急劇下降期相重合，以發(fā)揮VEGF促進血管再生的最大效果，以及觀察其是否對腮腺放射早期的微血管損傷有益。本研究結果顯示VEGF給藥后放療組、標準對照組與單純腮腺放療組的腮腺組織切片CD31陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異，即VEGF給藥放療組比單純放療組腮腺CD31陽性染色顆粒數(shù)明顯增高。結果證明放射前腮腺局部給予VEGF可以明顯提高腮腺放射后4小時的局部微血管密度與活性。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一組分子量較小的疏水性細胞膜整合蛋白，在細胞內負責調控水的進出。水通道蛋白1(AQP1)在涎腺組織中主要分布于血管內皮細胞和肌上皮細胞。在小鼠模型上研究發(fā)現(xiàn)放療前給予VEGF可提高頜下腺放射后AQP1的表達。本研究結果顯示標準對照組腮腺AQP1陽性染色顆粒數(shù)與VEGF給藥放射組及單純放射組有顯著差異，VEGF放療組與單純放療組間無明顯差異。我們認為原因可能是AQP1在小鼠頜下腺與小型豬腮腺中的分布比率不同，以及AQP1特異性著色細胞包括部分導管內皮細胞有關。

本研究結果證明放射前腮腺導管逆行注射外源性VEGF后，可使放射后腺體內微血管密度升高，改善腮腺局部血流狀況。通過腮腺導管逆行注射的方式給藥，簡便易操作，安全可靠，易于臨床應用。本研究為保護腮腺放射后微血管密度的降低提供了初步的大型動物實驗研究依據(jù)。

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