二苯羥乙酸糖酯酶促合成研究*

王宗君，胡文祥，張良軍

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850）

二苯羥乙酸糖酯酶促合成研究*

王宗君1，胡文祥2，張良軍1

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850）

二苯羥乙酸衍生物及糖類化合物分別具有重要的生理功能，二苯羥乙酸糖酯有可能同樣具有一定的生理價(jià)值。著重對(duì)這類化合物的酶促合成進(jìn)行探討，選擇定位合成二苯羥乙酸糖酯，收率達(dá)26%。

二苯羥乙酸糖酯；酶促合成；選擇定位

二苯羥乙酸酯類化合物多數(shù)具有重要的生理功能，其在軍事和民用上的重要運(yùn)用已得到廣泛認(rèn)同。例如，美國研究的抗膽堿能藥物二苯羥乙酸-3-奎寧酯（QNB）具有很強(qiáng)的擬精神作用，曾用作新型化學(xué)戰(zhàn)劑—失能劑，二苯羥乙酸-2-（二乙胺基）-乙酯的鹽酸鹽（Bewactyzine）是治療胃絞痛良藥之一[1]。糖類與多羥基環(huán)已烷類衍生物1，4-順-二羥基（一個(gè)α鍵，一個(gè)ε鍵）兩氧相距0.455 nm，與煙堿中兩個(gè)氧相距0.45 nm接近，這是該類化合物具有抗N樣膽堿作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]，二苯羥乙酸與糖類化合物形成的糖酯有可能同樣具有一定的生理價(jià)值，為此，本文旨在探討二苯羥乙酸糖酯的合成。傳統(tǒng)的糖酯合成方法，一般都需要反復(fù)地保護(hù)羥基、糖苷化、脫保護(hù)等操作，合成步驟多，路線長，分離和提純十分繁瑣和困難，近10年，酶促合成（Enzyrnatic Synthesis）糖酯是無保護(hù)基糖酯合成最有前途方法之一[3-4]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：紅外光譜 [FT-IR-408，KBr涂片]，1H-NMR[JNM-GX400，（CD3）2CO 作溶劑]，質(zhì)譜[MAT-711 型]。

試劑：葡萄糖、D-果糖、乳糖為分析純?cè)噭?，其余為化學(xué)純?cè)噭?，水為蒸餾水，脂肪酶（中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，酶比活力＞3 000 U/g），二苯羥乙酸三氯乙醇酯（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。

1.2 二苯羥乙酸甲酯的合成

二苯羥乙酸甲酯合成反應(yīng)式：

將11.412g（0.05 mol）二苯羥乙酸，89 mL無水甲醇，置于250 mL三口燒瓶中，攪拌加熱至45℃，開始滴加濃H2SO4，回流8 h，減壓蒸餾除去甲醇（＜70℃），所得物冰浴冷卻稀釋，20%Na2CO3堿化至pH=9，分出有機(jī)相和水相，水相經(jīng)乙醚提取，合并有機(jī)相，水洗、無水硫酸鎂干燥、真空濃縮，得白色顆粒狀晶體，產(chǎn)率68.6%，mp67.7℃。元素分析（C15H14O3），計(jì)算值（%）：C 74.37，H 5.82；實(shí)測值（%）

1.3 二苯羥乙酸甲酯與葡萄糖酶促反應(yīng)

在裝有溫度計(jì)，帶CaCl2干燥管的回流冷凝管100 mL三口圓底燒瓶中加入3.63 g（0.015 mol）二苯羥乙酸甲酯、6.48 g（0.036 mol）葡萄糖、3g活性酶A、50 mL無水吡啶作溶劑，用適量分子篩脫水、脫醇，油浴控溫50℃，攪拌80 h，抽濾、減蒸得紅褐色粘稠液體、經(jīng)水洗，二甲苯洗滌（二甲苯可微熱）、柱層析得淡黃色粘稠糖漿體。元素分析（C20H22O8），計(jì)算值（%）：C 61.53，H 5.68；實(shí)測值（%）：C 61.46，H 5.63。IR，（σ/cm-1，漫反射法）：3 388.6（νS，寬，締合 OH），1 720.4（m，C=O，雜質(zhì)），1 622.0（νs，C=O），1 500，1 470（苯環(huán)骨架振動(dòng)）。Ms（FAB，m/z）：391（M+1），373（M-OH 10%），211（（C6H5）2C（OH）CO+，100%）。

1.4 二苯羥乙酸三氯乙醇酯與D-果糖酶促反應(yīng)

二苯羥乙酸三氯乙醇酯與D-果糖酶促反應(yīng)式：

將5.71 g（15.88 mmol）二苯羥乙酸三氯乙醇酯，5.79 g（32.2 mmol）D- 果糖，2 g活性酶 A，50 mL無水吡啶，適量分子篩置于100 mL三口圓底燒瓶中，控溫50℃，磁力攪拌80 h，抽濾、洗滌（水洗2次，后用二甲苯洗滌），柱層析純化得紅棕色粘稠體。元素分析（C20H22O8），計(jì)算值（%）：C 61.53，H 5.68；實(shí)測值（%）：C 61.39，H 5.56。IR，（σ/cm-1，漫反射法）：3 450.0（VS，寬，締合 OH），1 700.4（W，C=O，雜質(zhì)）1 630.2（Vs,C=O），1 500，1 460（苯環(huán)骨架振動(dòng)），Ms（FAB，m/z）：391（M+1），3 73（M-OH 58%），105

1.5 二苯羥乙酸甲酯與（+）—乳糖酶促反應(yīng)

在100 mL三口圓底燒瓶中加入3.64 g（0.015 mol）二苯羥乙酸甲酯，10.27 g（0.03 mol）（+）—乳糖，50 mL無水吡啶，3 g活性酶B，適量分子篩脫水、脫醇，控溫50℃，攪拌回流80 h，抽濾，濃縮得紅棕色粘稠體。柱層析純化，薄層分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 二苯羥乙酸甲酯合成

本實(shí)驗(yàn)采用Fischer酯化法，根據(jù)相平衡濃度和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，采用甲醇過量，并控制適當(dāng)?shù)牡渭铀俣群秃銣貤l件，充分考慮催化酶活性因素。因反應(yīng)中有水生成，保持反應(yīng)的無水體系也相當(dāng)重要，通常加入一些脫水劑（分子篩）或通過蒸除去水的方法來保持體系無水。微波在有機(jī)合成方面文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)頗多，利用其已成功地完成了Diels-Alder反應(yīng)、Claisen反應(yīng)，重排、成環(huán)、碳烯反應(yīng)等，也有資料表明，超聲波技術(shù)也成功地運(yùn)用到了有機(jī)合成當(dāng)中，并且實(shí)現(xiàn)了固相化學(xué)反應(yīng)，對(duì)于中間體的合成，實(shí)驗(yàn)當(dāng)中比較了上述3種方法，結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，3種合成方法均能得到較理想的收率，超聲波、微波在有機(jī)合成過程中可以提高反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，耗能少，污染輕，更適合自動(dòng)化操作。

2.2 酶促反應(yīng)（Enzymatic Synthesis）結(jié)果分析

糖酯合成，一般要首先保護(hù)部分羥基，再糖苷化，脫保護(hù)基，分離提純過程非常繁雜，酶是具有高度不對(duì)稱性和生物活性的蛋白質(zhì)，在催化時(shí)表現(xiàn)出專一性、選擇性和高效性。實(shí)驗(yàn)過程中，運(yùn)用酶的催化活性，選擇定位合成二苯羥乙酸單糖酯和雙糖酯。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果見表2。

表1 二苯羥乙酸甲酯合成方法及結(jié)果Table 1 Synthetic methods and results of benzilic acid methyl ester

表2結(jié)果表明，酶促條件下，活化酯與糖的酯交換反應(yīng)是可以實(shí)現(xiàn)的，三氯乙醇酯的活性比甲酯高，單糖酯比雙糖酯的酯交換能力強(qiáng)。這是因?yàn)椤狾CH2CCl3比—OCH3結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，電負(fù)性高，更易離去，易被親核基團(tuán)所取代；二糖是單糖的二聚體，相對(duì)而言，空間位阻大，醇羥基極化效應(yīng)趨同，選擇定位性下降。

2.3 糖酯后處理

所得的粗產(chǎn)品為很粘稠的糖漿體，且伴著有色物。常規(guī)的萃取、蒸餾、重結(jié)晶等分離方法在純化糖酯方面有很大的困難，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用水相和有機(jī)相（乙醚）同時(shí)溶解混合物，將所得的有機(jī)相水洗除去未反應(yīng)的糖，二甲苯微熱洗滌除去未反應(yīng)的活化酯。然后，經(jīng)濃縮和高效分離手段——柱層析，分離效率可達(dá)90%以上。

3結(jié)論

（1）在合成二苯羥乙酸甲酯過程中，采用了傳統(tǒng)的Fischer法和現(xiàn)代合成技術(shù)——微波催化和超聲波催化，均得到了可觀的產(chǎn)率，后兩者在時(shí)間和操作方面具有大的優(yōu)勢。

表2 糖酯酶促合成方法及結(jié)果Table 2 Synthetic methods and results of sugar esters of benzilic acid

（2）在合成活化酯中間體的基礎(chǔ)上，探索了活化酯與糖類進(jìn)行酯交換酶促反應(yīng)條件，這種合成方法比傳統(tǒng)糖酯合成方法簡便，易操作，產(chǎn)率要高。

[1]Nishikawar，et al.Facil enzymatic preparation of monoacylated sugars inpyridine[J].Chen Pharm Bull，1992（24）：387.

[2]胡文祥，惲榴紅.抗膽堿能藥物抗N樣作用的分子藥理學(xué)研究[J].科學(xué)通報(bào)，1984，39（1）：79-81.

[3]曹淑桂.有機(jī)溶劑中酶催化研究的新進(jìn)展[J].化學(xué)通報(bào)，1995（3）：5-13.

[4]Therisod M，Klibanov Am.Regioselectiveacylation of secondary hydroxyl groups in sugars catalyzed by lipase in organic solvents[J].J Am Chem Soc,1987(109)：3977-3981.

Study on Enzymatic Synthesis of Sugar Esters of Benzilic Acid

WANG Zong-jun1，HU Wen-xiang2，ZHANG Liang-jun1
（1.Guangxi Vocational＆ Technical Institute of Industry，Guangxi Nanning 530001，China；2.Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

The derivatives of benzilic acid and fructose are significan in life sciences.Carbohdrate molecules represent a particularly challenging target for regioselective modifications due to their multitive hydroxyl groups.The l-fructopyranosyl benzilate was synthesized by enzyme-catalyzed regioselective etherification of fructose and actived esters of diphenyl glycolic acid in anhydrous pyridine with porcine pancreatic lipase.The yield of the product was 26%.

Sugar Esters of Benzilic Acid；Enzymatic Synthesis；Regioselective

TQ464.1

A

1671-0460（2010）01-0017-03

2010-02-03

王宗君（1972-），男，湖南祁東人，講師，工程師，碩士，2007年畢業(yè)于廣西大學(xué)化工工藝專業(yè)，從事有機(jī)物合成方向的研究。E-mail：gxwzj@china.com.cn。