反相高效液相色譜法測定復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片的含量

初立梅，徐健峰，石 濤，徐康康

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，江蘇 南京 210008； 2.南京威爾曼藥物研究所，江蘇 南京 210009；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009）

氨基葡萄糖被廣泛地用于緩解骨關(guān)節(jié)病的癥狀，目前已上市的氨基葡萄糖類藥品包括鹽酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖氯化鉀(鈉)復(fù)鹽和硫酸氨基葡萄糖。Elson-Morgan法是這類物質(zhì)含量的經(jīng)典檢測法[1]，雖經(jīng)數(shù)十年的改進[2-3]，但操作仍顯煩瑣。高效液相色譜（HPLC）法是近年來的研究熱點。美國藥典（USP30）采用示差檢測法進行氨基葡萄糖的分析檢測，但此方法對環(huán)境溫度要求較嚴苛，操作具有一定的局限性。本研究采用柱前衍生化后，用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定硫酸氨基葡萄糖分散片的含量，旨在為氨基葡萄糖的含量測定提供更好的檢測方法。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP泵，島津SPD-10AVP紫外檢測器，7725i進樣閥，HW色譜工作站；BP 211Dsartorius分析天平。鹽酸氨基葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所）；硫酸軟骨素對照品（Sigma公司）；復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片（南京威爾曼藥物研究所，批號為 20081213，20081215，20081217）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Hypersil C18柱 (50 mm ×4.6 mm，5!m)；流動相：三水合乙酸鈉水溶液（6.80 g三水合乙酸鈉，加入700 mL水使溶解，用醋酸調(diào) pH 至 5.9，加水至 1 000 mL，搖勻）-甲醇（90∶10）；流速：1.0 mL/min;柱溫：室溫；檢測波長：340 nm；進樣量：20!L。在給定的色譜條件下，配制質(zhì)量濃度為1 g/L的對照品溶液，按衍生化方法衍生后進樣，記錄色譜圖(圖1)?？梢婝}酸氨基葡萄糖的保留時間為4.728 min，分離度為7.136，拖尾因子為1.368，理論塔板數(shù)為3 857。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的鹽酸氨基葡萄糖對照品適量，加水制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，作為對照品溶液。取樣品20片，研細，精密稱取粉末適量（相當于鹽酸氨基葡萄糖100 mg），置100 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，于快速混勻器上混勻使粉末懸浮，65℃水浴加熱20 min，置磁力攪拌器上攪拌5 min，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.3 衍生化方法

取0.2 mol/L的硼酸鹽緩沖液400!L，置一小瓶中，加入100!L衍生化試劑和100!L對照品溶液或供試品溶液，混合，衍生化1 min后進樣，記錄色譜圖。結(jié)果 !-異構(gòu)體與 "-異構(gòu)體的保留時間之比為1.6～1.7，!-異構(gòu)體的出峰時間在4 min左右，故可以 !-異構(gòu)體的峰面積計算鹽酸氨基葡萄糖的標示含量。

2.4 方法學(xué)考察

干擾性試驗：取處方量硫酸軟骨素及空白輔料適量，照供試品溶液的制備方法操作，按衍生化方法衍生后進樣，記錄色譜圖。結(jié)果硫酸軟骨素及空白輔料對硫酸氨基葡萄糖的含量測定無干擾。

破壞試驗：取批號為20081213的樣品20片，研細，精密稱取粉末適量，分別置100 mL量瓶中，分別加入1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液、30%雙氧水各1 mL，另取處方量的空白輔料及硫酸軟骨素同法操作，放置1 h后分別用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)pH至中性，照供試品溶液的制備方法操作，按衍生化方法衍生后進樣。結(jié)果酸、堿、氧化破壞試驗的圖譜與未破壞的供試品溶液圖譜相比，峰面積均減小，但無雜質(zhì)峰，表明在此測定方法下主藥的降解產(chǎn)物對含量測定無影響。

線性關(guān)系考察：精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的鹽酸氨基葡萄糖對照品298.65 mg，置100 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻作為貯備液。精密量取貯備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為300，600，900，1 200，1 500!g/mL 的系列溶液。分別取 100!L 按衍生化方法衍生后進樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 A=167.28 C+33 147，r=0.999 7（n=5）。結(jié)果表明鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度在300～1 500!g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率試驗：按樣品處方量精密稱取硫酸氨基葡萄糖氯化鈉復(fù)鹽適量（標示量的80%，100%，120%），置100 mL量瓶中，分別加入處方量的硫酸軟骨素及空白輔料，照供試品溶液的制備方法操作；另精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的鹽酸氨基葡萄糖對照品適量，加水制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，作為對照品溶液。分別取對照品溶液及供試液品溶各100!L，按衍生化方法衍生后進樣，記錄色譜圖，按外標法以"-異構(gòu)體峰面積計算回收量及回收率。結(jié)果平均回收率為102.68%，RSD為1.08%(n=9)，表明方法的回收率良好。

進樣精密度試驗：取樣品適量，研細，精密稱取粉末適量（相當于鹽酸氨基葡萄糖100 mg），置100 mL量瓶中，依法制備供試品溶液，按衍生化方法衍生后進樣。結(jié)果峰面積的 RSD=0.46%（n=6），表明進樣精密度良好。

中間精密度試驗：按2005年版《中國藥典（二部）》要求，取批號為081212的樣品，由不同人員于不同日期在不同儀器上依法測定含量，測定結(jié)果與重現(xiàn)性試驗前3份的結(jié)果一起計算。結(jié)果的RSD為0.67%，表明方法中間精密度良好。

重現(xiàn)性試驗：精密稱取同批樣品6份，按供試品溶液的制備方法操作，按衍生化方法衍生后進樣測定含量。結(jié)果平均含量為99.94%，RSD為0.54%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重現(xiàn)性試驗項下的第6份供試品溶液，室溫下留樣，分別于 0，2，4，6，8 h 時取 100!L，按衍生化方法衍生后進樣。結(jié)果的 RSD為0.59%（n=5），表明供試品溶液在室溫條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品含量測定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法操作，按衍生化方法衍生后進樣，記錄色譜圖，按外標法以"-異構(gòu)體的峰面積計算標示含量。結(jié)果批號為20081213，20081215，20081217的3批樣品中硫酸氨基葡萄糖的含量分別為100.9%，101.9%，101.0%。

3 討論

硫酸氨基葡萄糖無特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外區(qū)，在此波長下檢測時對流動相、試劑純度、儀器穩(wěn)定性等要求較高。因此，在本試驗中采用了衍生化方法。硫酸氨基葡萄糖是以氨基葡萄糖為母體和氯化鈉形成的復(fù)鹽，氨基葡萄糖與衍生化試劑鄰苯二甲醛、3-巰丙酸可衍生化生成衍生物。該衍生物穩(wěn)定，分子吸收系數(shù)大，在RP-HPLC系統(tǒng)中具有很好的色譜性質(zhì)，且專屬性強。

本研究建立了柱前衍生化法，采用RP-HPLC法測定復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片的含量，方法可行，結(jié)果準確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[1]Elson LA，Morgan WTJ.A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine[J].Biochem J，1933，27(6):1824-1828.

[2]Johnston JP，Ogston AG，Stanier JE.A modification of the elson and morgon method for the estimation of glucosamine[J].Analyst，1951，76:88-89.

[3]El-Saharty YS，Bary AA.High-performance liquid chromatographic determination of neutraceuticals，glucosamine sulphate and chitosan，in raw materials and dosage forms[J].Analytica Chimica Acta，2002，462(1):1 251.