運(yùn)動(dòng)頻率和遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

婁淑杰,刁 瑋,陳佩杰

運(yùn)動(dòng)頻率和遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

婁淑杰,刁 瑋,陳佩杰

目的:探討運(yùn)動(dòng)頻次和隔周遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。方法:將60只雄性5周齡SD大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照(C)組、每天運(yùn)動(dòng) (E0)組、隔1日運(yùn)動(dòng)(E1)組、隔3日運(yùn)動(dòng)(E3)組、隔周運(yùn)動(dòng)(E7)組和隔周遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(E7I)組。運(yùn)動(dòng)方式為跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。腹腔注射BrdU于各組大鼠,持續(xù)注射6天。采用免疫組織熒光染色技術(shù),檢測(cè)各組大鼠海馬齒狀回內(nèi)新生細(xì)胞和新生神經(jīng)元數(shù)量。結(jié)果:各組動(dòng)物海馬齒狀回內(nèi)BrdU免疫陽性(BrdU+)細(xì)胞數(shù)目為:C組37.62±9.02,E0組46.01±10.82,E1組49.06±12.07,E3組41.20±11.02,E7組37.23±16.45,E7I組53.97±10.67。各組大鼠海馬齒狀回內(nèi)BrdU和NeuN免疫雙陽性(BrdU++NeuN+)細(xì)胞數(shù)分別為:C組 15.26±4.42;E0組17.61± 3.86,E1組21.93±5.60,E3組16.28±5.37,E7組 15.80±7.50,E7I組24.99±5.44。結(jié)論:在間隔不同時(shí)間的小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中,隔日小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)最有利于大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生;隔周遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度也有利于大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生。

BrdU;NeuN;神經(jīng)發(fā)生;海馬;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

神經(jīng)發(fā)生過程包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活等幾個(gè)重要環(huán)節(jié),每個(gè)環(huán)節(jié)都可能會(huì)影響到新生細(xì)胞和新生神經(jīng)元的最終數(shù)目。1992年,Reynodls等從成年小鼠腦紋狀體中分離出能夠在體外不斷分裂增殖且具有多種分化潛能的細(xì)胞群,并提出了神經(jīng)干細(xì)胞這一概念[14]。成年哺乳動(dòng)物的神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),其中有兩個(gè)最主要的神經(jīng)干細(xì)胞聚集區(qū),即側(cè)腦室壁的腦室下層和海馬齒狀回的顆粒下層[9,10]。豐富的環(huán)境、適度運(yùn)動(dòng)、腦缺血等都可一定程度的誘導(dǎo)海馬齒狀回部位的神經(jīng)發(fā)生[11,15,16]。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn),持續(xù) 7天的小強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)即可明顯誘導(dǎo)幼齡大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生,但大強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng) 7天則缺失誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)[3]。如何控制運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)頻次才能更好地持續(xù)發(fā)揮運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)呢?鑒于此,本研究通過免疫組織熒光染色方法,觀察了不同運(yùn)動(dòng)間隔時(shí)間和遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大鼠海馬齒狀回新生細(xì)胞數(shù)量的影響,以及新生細(xì)胞分化為神經(jīng)元的情況,探討促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的最適宜運(yùn)動(dòng)方式,從而為通過合理運(yùn)動(dòng)以促進(jìn)腦發(fā)育和提高腦功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

健康雄性5周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,購買于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,平均體重為(106.50±5.46)g。將其隨機(jī)分為6組,分別為安靜對(duì)照組(C)、每天運(yùn)動(dòng)(E0)組、隔1日運(yùn)動(dòng)組(E1)、隔3日運(yùn)動(dòng)(E3)組、隔周運(yùn)動(dòng)(E7)組和隔周遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度(E7I)組。每組10只。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲食,光照時(shí)間為7:00～19:00,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20℃±2℃。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案及注射BrdU

采取遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的建立依據(jù)Bedford模型[7],并結(jié)合實(shí)際情況加以調(diào)整。運(yùn)動(dòng)方案分別為:1)小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng):首先以5m/min的速度運(yùn)動(dòng)5 min,接著速度加至8 m/min持續(xù)5 min,最后以11 m/min的速度持續(xù)跑20 min。2)中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng):首先以8 m/min的速度跑5 min,接著速度加至11 m/min持續(xù)5 min,最后以14 m/min的速度運(yùn)動(dòng)20 min。3)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng):首先以8 m/min的速度跑5 min,接著速度加至11 m/min持續(xù)5 min,最后以22 m/min的速度運(yùn)動(dòng)20 min。除了隔周遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組,即第1周為小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),第2周為中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,第3周為大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),其他各運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物都采用小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。每天固定時(shí)間段在跑臺(tái)上運(yùn)動(dòng) 30 min。BrdU腹腔注射(50 mg/kg體重)在動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)前1 h完成,在實(shí)驗(yàn)的最后6天持續(xù)注射,每天1次。

1.3 動(dòng)物取材和免疫熒光雙標(biāo)計(jì)染色

腹腔注射10%的水合氯醛(35 mg/100 g體重)麻醉大鼠,然后將其固定于手術(shù)臺(tái)上,打開腹腔,暴露心臟,從心臟左心室尖處依次灌注0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛。固定后斷頭,取出腦組織放入4%多聚甲醛中進(jìn)行后固定過夜。次日再移入15%蔗糖溶液中約12 h,腦組織沉底后再移入30%蔗糖溶液中30 h以上,待腦組織再次沉底后用于制作冰凍切片,切片厚度為25μm,使用BrdU抗體(1∶600,大鼠來源,Gene Tex公司)、NeuN抗體(1∶100,小鼠來源,Milli Pore公司)及羅丹明和 FITC分別標(biāo)記的二抗(1∶100,Santa Cruz Biotechnology公司),按常規(guī)方法對(duì)腦組織切片進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記染色。

1.4 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過倒置熒光顯微鏡(LEICA DM IRB)和萊卡圖像分析軟件(Qwin V3)進(jìn)行圖像采集處理。每只大鼠海馬部位每隔3張選取1張腦切片,共6張,在100放大倍數(shù)下對(duì)海馬齒狀回分別進(jìn)行BrdU+免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU+/ NeuN+細(xì)胞計(jì)數(shù),結(jié)果采用整個(gè)圖像平面視野內(nèi)的BrdU+細(xì)胞個(gè)數(shù)和BrdU+/NeuN+細(xì)胞個(gè)數(shù)表示;然后以每個(gè)大鼠6張切片中所標(biāo)記的BrdU+細(xì)胞的平均數(shù)表示該大鼠海馬齒狀回新生細(xì)胞數(shù),以每個(gè)大鼠6張切片中所標(biāo)記的BrdU+/NeuN+細(xì)胞的平均數(shù)表示該大鼠海馬齒狀回新生細(xì)胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),以判斷多組間的顯著性差異。P <0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

免疫熒光實(shí)驗(yàn)中與BrdU抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的第二抗體為羅丹明標(biāo)記的山羊抗大鼠 IgG,它在激發(fā)狀態(tài)下發(fā)出紅色熒光,標(biāo)記新生細(xì)胞;與NeuN抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的第二抗體為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,它在激發(fā)狀態(tài)下發(fā)出綠色熒光,標(biāo)記神經(jīng)元。由于BrdU和NeuN在神經(jīng)細(xì)胞中的著色位置都是在細(xì)胞核內(nèi),所以細(xì)胞如果既呈BrdU+又呈NeuN+,則紅色與綠色相疊加呈橘黃色熒光,標(biāo)記新生神經(jīng)元(圖1)。

圖1 大鼠海馬齒狀回內(nèi)免疫熒光染色標(biāo)記BrdU和NeuN染色圖Figure 1. Immunofluorescence Staining of the Dentate Gyrus of Hippocampus in SD Rats

圖2所示為各組大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)目:C組為37.62±9.02;E0組為46.01±10.82;E1組為49.06 ±12.07;E3組為41.20±11.02;E7組為37.23±16.45; E7I組為53.97±10.67。其中,E0組BrdU+細(xì)胞數(shù)量較C組增長(zhǎng)了19.61%,E1組較C組增加了30.40%,E7I組較C組增加了43.46%。圖3所示為幾組大鼠海馬齒狀回BrdU++NeuN+細(xì)胞數(shù):C組為15.26±4.42;E0組為17.61±3.86;E1組為 21.93±5.60;E3組為16.28± 5.37;E7組為15.80±7.50;E7I組為24.99±5.44。其中,E0組BrdU++NeuN+細(xì)胞數(shù)量較C組增長(zhǎng)了15.39%, E1組BrdU++NeuN+細(xì)胞數(shù)量較C組增加了43.70%,E7I組較C組增加了63.76%。

圖2 各組大鼠海馬齒狀回內(nèi)BrdU+細(xì)胞數(shù)量比較圖Figure 2. Comparison for the Number of BrdU+Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Rats

圖3 各組大鼠海馬齒狀回內(nèi)BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)量比較圖Figure 3. Comparison for the Number of BrdU+/NeuN+Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Rats

3 討論

運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的影響,源于運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的刺激作用,機(jī)體通過對(duì)刺激產(chǎn)生反應(yīng)而產(chǎn)生對(duì)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng),所以不同的運(yùn)動(dòng)頻率和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的影響。顧麗燕等研究發(fā)現(xiàn),與每周3次的無負(fù)重游泳相比,每周6次的無負(fù)重游泳能引起大鼠血清丙二醛含量降低,血清總抗氧化能力上升[2],提示運(yùn)動(dòng)引起的機(jī)體抗氧化效應(yīng)增強(qiáng)需要一定的運(yùn)動(dòng)頻率。Schweitzer等發(fā)現(xiàn),無論一周兩次還是隔日轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng),與對(duì)照組相比都可以明顯提高大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,可明顯改變與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)[13],但不同運(yùn)動(dòng)頻率對(duì)幼齡大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響還未見報(bào)道。本研究分別觀察了每日、隔1日、隔3日和隔周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響,發(fā)現(xiàn)每日和隔1日跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)皆可明顯大鼠誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生,且以隔1日跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的促神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)最明顯,但隔3日和隔周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)則對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生沒有明顯影響。關(guān)于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)與多種神經(jīng)營養(yǎng)類因子相關(guān),如與運(yùn)動(dòng)引起B(yǎng)DNF、VEGF、EPO、谷氨酸受體等基因表達(dá)和蛋白合成增加有關(guān)[6-8]。在本研究中,隔3日和隔周運(yùn)動(dòng)雖然可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激,但因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)間隔時(shí)間過長(zhǎng),使運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)因子生成量不足以持續(xù)幾天刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖。而隔日運(yùn)動(dòng)既可保持運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的有效刺激作用,誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)因子的表達(dá),又由于間隔時(shí)間短從而可維持有效濃度,此可能是隔日運(yùn)動(dòng)可獲得明顯促神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)的原因所在。

以前研究發(fā)現(xiàn),同一強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)2周引起的大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生水平較持續(xù)運(yùn)動(dòng)1周要低[7],分析是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了適應(yīng),使得運(yùn)動(dòng)的刺激性減弱,導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)性有所降低,而要獲得持續(xù)的刺激作用,就要不斷增加運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。為此,本研究比較了C組、E0組和 E7I組神經(jīng)發(fā)生情況,發(fā)現(xiàn)E0組和E7I組與C相比,大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞及BrdU++NeuN+細(xì)胞數(shù)量顯著增加,而且E7I組大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞和BrdU++NeuN+細(xì)胞數(shù)量也高于 E0組,提示合理遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可克服機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的適應(yīng),有利于維持運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)效應(yīng)。與此相一致,8周遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的有氧訓(xùn)練可明顯增加VEGF在成年大鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)[1];10天和6周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)可增加大鼠海馬神經(jīng)元表達(dá)BDNF[4,5]。所以,要獲得運(yùn)動(dòng)的促神經(jīng)發(fā)生效應(yīng),既要考慮到運(yùn)動(dòng)頻率,也要考慮到運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,核心是要維持運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的有效刺激作用。

4 結(jié)論

1.運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用依賴于適度的運(yùn)動(dòng)頻率,本研究中以隔日小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)效果最明顯。

2.隔周遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可克服機(jī)體對(duì)同一運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度產(chǎn)生的適應(yīng),從而維持運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的有效刺激作用。

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Effect of Exercise Frequency and Increasing Intensity Exercise on Hippocampal Neurogenesis in Rats

LOU Shu-jie,DIAO Wei,CHEN Pei-jie

Objective:To investigate effects of movement frequency and incremental exercise intensity on hippocampal neurogenesis in rats.Methods:Sixty male SD rats of 5-week-old were randomly divided into 6 groups:The sedentary control(C)group,the everyday exercise(E0) group,the every other day exercise(E1)group,the every three days exercise(E3)group,the every other week exercise(E7)group and the every other week increasing intensity exercise (E7I)group.All rats except C group were forced to run on treadmill.Immunofluorescence staining was used to evaluate the level of neurogenesis.Results:The number of BrdU positive cells in dentate gyrus of hippocampus was 37.62±9.02 in C group,46.01±10.82 in E0 group,49.06±12.07 in E1 group,41.20±11.02 in E3 group,37.23±16.45 in E7 group,53.97±10.67 in E7I group,respectively.Conclusions:Among all small intensity exercises which have different exercise frequency,the every other day exercise is most benefit of hippocampal neurogenesis in SD rats,the every other week increasing intensity exercise also is benefit of hippocampal neurogenesis in SD rats.

B rdU;NeuN;neurogegesis;hippocampus;rat;animal ex periment

G804.2

A

1000-677X(2010)01-0066-04

2009-08-11;

2009-11-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30570899);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(S30802)。

婁淑杰(1963-),女,內(nèi)蒙古人,副教授,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與腦健康,Tel:(021)51253243,E-mail:shujielou319@yahoo.com.cn。

上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海200438

Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.