提高大豆分離蛋白乳化性的工藝優(yōu)化及性質(zhì)分析*

陳俊高，遲玉杰，2，王喜波，于翠

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030)2(大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)

提高大豆分離蛋白乳化性的工藝優(yōu)化及性質(zhì)分析*

陳俊高1，遲玉杰1，2，王喜波1，于翠1

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030)2(大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)

采用三聚磷酸鈉(STP)對大豆分離蛋白(SPI)進行磷酸化改性，通過L16(45)正交試驗設(shè)計和SPSS分析軟件對工藝條件進行優(yōu)化，并對磷酸化改性前后的蛋白樣品進行疏水性、紅外光譜和電鏡掃描(SEM)3方面的分析測定，確認STP對SPI所產(chǎn)生的磷酸化作用。結(jié)果表明:4個試驗因素對乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響順序為STP添加量＞SPI濃度＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度;適宜的磷酸化反應(yīng)條件為SPI濃度13%，STP添加量10%，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間3.5 h。在最適工藝條件下，經(jīng)磷酸化改性后的SPI產(chǎn)品的乳化活性從0.293提高到0.785，乳化穩(wěn)定性從17.8提高到26.2，分別提高了168%和47%。

大豆分離蛋白，磷酸化，乳化性，工藝，性質(zhì)

大豆分離蛋白(SPI)由于有著較高的營養(yǎng)價值、資源豐富、生產(chǎn)成本低廉并能有效改善食品品質(zhì)與加工性能等諸多優(yōu)點，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛［1］。乳化性作為SPI功能特性中的一種重要性質(zhì)，使得添加有SPI的食品體系保持穩(wěn)定的乳化狀態(tài)從而達到延長貨架期的目的。然而，在弱酸性(pH值3～6)條件下，相對較差的溶解性和乳化性限制了其在酸性食品，如咖啡增白劑、酸性飲料、酸奶和注入型及非注入型調(diào)味汁等中的應(yīng)用范圍［2－3］，況且，現(xiàn)有大豆分離蛋白乳化性并不是太高。因此，需要對原有的SPI進行改性從而強化其乳化性。

常用于改善SPI功能性質(zhì)的方法有物理方法和化學(xué)方法。由于化學(xué)方法反應(yīng)歷程短、成本低、設(shè)備要求不高，且改性效果最為明顯，因此，化學(xué)改性仍然是目前蛋白質(zhì)改性的主要手段。常用的化學(xué)改性方法有糖基化、?；⑺崽幚?、去酰胺和磷酸化等［4－6］。由于磷酸化改性價格低廉、效果較好、對食品蛋白的消化率無明顯影響［7］、安全可靠且能大規(guī)模生產(chǎn)，是提高蛋白功能性的有效手段之一。其作用機理是選擇性利用蛋白質(zhì)側(cè)鏈活性基團，如Ser、Thr的—OH或Lys的ε-NH2，分別共價連接一個磷酸根，形成—O—PO32－或—N— PO32－的酯化反應(yīng)，繼而引進大量的磷酸根基團［8，9］。在SPI分子上導(dǎo)入負電性的磷酸根基團可以降低蛋白質(zhì)的等電點，從而改善其在弱酸性環(huán)境中的溶解性和乳化性［10］。

本文主要研究采用三聚磷酸鈉(STP)對SPI進行磷酸化改性，對改性階段工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定制備高乳化性SPI的最佳生產(chǎn)工藝條件，為高乳化型SPI粉的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，黑龍江省哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;大豆油，九三集團哈爾濱惠康食品有限公司;三聚磷酸鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;十二烷基磺酸鈉(SDS)為化學(xué)純;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BüChi Spray Dryer B-290型噴霧干燥儀(瑞士BüChi Spray Dryer公司)，KND-HYP8型消化爐(上海纖檢儀器有限公司)，KDN-2008全自動定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)，722型分光光度計(天津市普瑞斯儀器有限公司)，JJ-2B高速組織搗碎機(金壇市榮華儀器制造有限公司)，F(xiàn)S-1可調(diào)高速勻漿機(金壇市榮華儀器制造有限公司)，LD4-2A型離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，F(xiàn)E20型pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，983G型紅外分光光度(計美國PERKIN-ELMER公司)，S-3400S掃描電鏡(SEM)(日本日立公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 磷酸化SPI的制備

用蒸餾水把大豆分離蛋白配制成一定濃度的懸浮液，添加一定量的三聚磷酸鈉(按SPI質(zhì)量計)，均質(zhì)處理后，將反應(yīng)容器置于一定溫度的水浴鍋中，并控制體系的pH值在8.0左右，不斷攪拌使之反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后把樣品的pH值調(diào)到4.0使蛋白質(zhì)沉淀，2 000 r/min離心15 min，水洗沉淀蛋白質(zhì)2～3次，回調(diào)蛋白質(zhì)pH值至7.0并稀釋至合適濃度，噴霧干燥即為改性后的大豆分離蛋白。

1.3.2 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

本實驗采用濁度法［11］，略作改進為:用 pH值7.0，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制100mL 10g/L(m/V)的蛋白懸浮液，取30mL蛋白液于高速勻漿機中，加入10mL大豆油，10 000 r/min均質(zhì)1 min以形成乳濁液，均質(zhì)后，分別在0 min與10 min時從底部吸取100μL分散于10mL 1g/L SDS中，于500 nm處測定吸光度值(測定3次取平均值)，以A0×100表示乳化活性(EAI)，乳化穩(wěn)定性(ESI)的表示方法為:

式中:ESI單位為min;A0，0 min時的吸光度值;ΔT，測定乳化性的2次時間間隔，本試驗取10 min;A10，10 min時的吸光度值。

1.3.3 磷酸化程度的測定

(1)總磷的測定:參照GB/T5009.87－2003食品中磷的測定。

(2)無機磷的測定［12］:準確稱取試樣 1 g，置于100mL容量瓶中，加10mL HCl和HNO3數(shù)滴，加水30mL，加入2滴酚酞，用 NaOH滴至淡紅色，再加0.3mL HNO3，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初始的30mL濾液，為試樣分解液。其余操作同總磷的測定。

1.4 試驗設(shè)計

在前期預(yù)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定選取SPI濃度、STP添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為考察變量，以乳化活性和乳化穩(wěn)定性為考察指標，進行L16(45)的正交試驗。試驗的因素水平見表1，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

表1 L16(45)正交試驗因素水平表

1.5 磷酸化SPI性質(zhì)分析

1.5.1 蛋白質(zhì)表面疏水性測定

表面疏水性是采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)作為熒光探針進行測定［13］。將蛋白質(zhì)溶于0.1mol/L，pH值7.0磷酸鹽緩沖液中，在室溫下間歇攪拌約30 min，配制成10mg/mL蛋白質(zhì)分散體系，在高速均質(zhì)機上均質(zhì)(10 000 r/min，1 min)，然后離心(3 000 r/min，20 min)，取上清液并用考馬斯亮蘭法測定溶液中蛋白濃度，然后用相同的緩沖液將上清液稀釋成不同的濃度梯度(濃度為0.01～0.2mg/mL)。取10mL不同濃度的樣品溶液，分別加入50μL ANS溶液(在 0.1mol/L，pH值 7.0磷酸鹽緩沖液中含 8 mmol/L)。使用熒光分光光度計分別在338 nm(激發(fā)波長)496 nm(發(fā)射波長)下測定熒光強度(FI)。以熒光強度(FI)對蛋白質(zhì)濃度作圖，計算曲線的初始斜率為疏水性指數(shù)。

1.5.2 紅外光譜分析

采用傅立葉紅外光譜儀對上述四種樣品進行紅外吸收光譜分析，對磷酸化反應(yīng)的實質(zhì)進行驗證。分析方法為:取適量待測蛋白樣品，同磨碎的KBr粉末混合，壓片后置于紅外光譜儀中全波段(400～4 000cm－1)掃描分析，以KBr作為空白，每個樣品紅外光譜圖為多次掃描的疊加圖。

1.5.3 掃描電鏡

將試驗制備所得的粉狀樣品置于105℃條件下干燥至恒重，取適量樣品粘于觀察臺上，然后鍍膜，置于S－3400N掃描電鏡下，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗方案及結(jié)果

依照表1的試驗水平和L16(45)的正交表設(shè)計試驗方案并進行試驗，表2為正交試驗方案及結(jié)果。

2.2 試驗結(jié)果的方差分析及工藝優(yōu)化

利用SPSS提供的一般線性模型中的Multivariate過程，對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較，分別見表3和表4。

從表3方差分析的結(jié)構(gòu)可以看出，乳化活性和乳化穩(wěn)定性校正模型的P值均＜0.05，說明本次的試驗設(shè)計是有意義的。對于乳化活性這一考察指標來說，因素SPI濃度的P值為0.003＜0.01;STP添加量的P值為0.002＜0.01;反應(yīng)溫度的P值為0.055＞0.05;反應(yīng)時間的P值為0.02＜0.05，所以只有反應(yīng)溫度這一因素對改性后SPI乳化活性的影響不顯著，其余3因素都有顯著意義，且影響的主次順序為:STP添加量＞SPI濃度＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度。對乳化穩(wěn)定性這一考察指標進行分析可以得到同樣的結(jié)論。

表2 L16(45)正交試驗方案與結(jié)果

表3 方差分析表

表4 各試驗因素對EAI和ESI的影響

由表4分析可知，隨著SPI濃度的不斷增大，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈增加的趨勢，在較低SPI濃度時2個考察指標增加幅度不顯著，當SPI濃度增大至11%(水平3)時，增幅極顯著。由此可見，欲得到高乳化性的SPI，原粉濃度應(yīng)該越高越好，但考慮到工業(yè)實際生產(chǎn)時，噴粉前蛋白漿料的濃度在13%左右，故SPI原粉的濃度選擇水平4(13%)較為適宜。隨著STP添加量的增加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢。STP添加量在較低水平時，乳化活性和乳化穩(wěn)定性不同處理間的差異不顯著，當STP添加量增至8%(水平3)時，不同處理間差異顯著，當STP繼續(xù)增大時，在P＜0.01水平上不同處理間差異不顯著，故為了制備高乳化性的SPI產(chǎn)品，STP添加量選擇水平4(10%)較適宜。隨著反應(yīng)體系溫度的升高，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈緩慢遞增的趨勢，當溫度達到40℃后，處理間不再有顯著差異，故本著節(jié)約能源和經(jīng)濟的角度，反應(yīng)溫度選擇水平2(40℃)較為合適。隨著反應(yīng)時間的不斷延長，乳化活性和乳化穩(wěn)定性總體呈上升趨勢，在較低處理水平時，不同反應(yīng)時間處理間差異不顯著，當反應(yīng)時間繼續(xù)延長至3.5 h時，處理間差異顯著，故反應(yīng)時間選擇水平4(3.5 h)較為適宜。

綜上所述，采用磷酸化改性提高SPI乳化性的最適工藝條件為:SPI濃度13%，STP添加量10%，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間3.5 h。由于得到的SPI磷酸化改性工藝的較優(yōu)組合參數(shù)在正交試驗內(nèi)未出現(xiàn)，因此補作這部分的試驗。在此工藝條件下進行了3次重復(fù)試驗(數(shù)據(jù)未列出)，得到乳化活性的平均值為0.785，乳化穩(wěn)定性的平均值為26.2。說明磷酸化改性的方法可以提SPI粉的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

2.3 磷酸化程度對乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

磷酸化SPI乳化活性與乳化穩(wěn)定性隨磷酸化程度的變化如圖1所示。在所考察的范圍內(nèi)隨著磷酸化程度的增加，改性后SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性也不斷提高。與大豆分離蛋白原粉(未改性產(chǎn)品)相比，經(jīng)磷酸化改性后的SPI產(chǎn)品的乳化活性從0.293提高到0.785，乳化穩(wěn)定性從17.8 min提高到26.2 min，分別提高了168%和47%。分析其原因，可能是由于磷酸化改性使蛋白質(zhì)引進了大量的磷酸根基團，增加了蛋白質(zhì)體系的電負性，從而提高了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，使之在乳化體系中更易分散，相互排斥，從而提高了溶解度和聚結(jié)穩(wěn)定性;同時由于磷酸化改性使蛋白質(zhì)暴露了疏水基團，提高了蛋白質(zhì)的親油性，有利于蛋白分子在乳化過程中在油-水界面擴散和重排定位，從而更易形成乳狀液滴，因此改性后蛋白的乳化能力及乳化穩(wěn)定性都有顯著的改善，這與盧寅泉等［14－15］的研究結(jié)果一致。

圖1 磷酸化程度對乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

2.4 磷酸化SPI性質(zhì)變化

2.4.1 蛋白質(zhì)表面疏水性

磷酸化改性前后SPI在不同pH值和不同溫度溶液中疏水性的變化如圖2所示。由圖2(a)可知，改性前后SPI樣品的疏水性指數(shù)在一定pH值范圍內(nèi)隨著pH值的增加而增加，尤其在pH值8.0時均達到最大值。這可能是因為pH值增加造成蛋白分子的構(gòu)型變化或使蛋白質(zhì)疏水基團暴露［16］。同時可以看到，經(jīng)磷酸化改性后的SPI樣品在各pH值條件下均較未改性樣品的疏水性有顯著性的提高(P＜0.05)，約提高0.8～1倍左右。由圖2(b)可知，橫向上，改性前后SPI樣品的疏水性指數(shù)在一定范圍內(nèi)隨著溶液溫度的升高呈顯著性(P＜0.05)增加，分別由20℃的 501.6和 1 008.2增至 80℃ 的 750.4和1 290.3。這可能是由于SPI含有大量的疏水性氨基酸側(cè)鏈(尤其是分子內(nèi)部)，通過加熱，蛋白質(zhì)分子就從卷曲狀態(tài)舒展開來，原來包在卷曲結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團就暴露出來，而原來在蛋白質(zhì)分子卷曲結(jié)構(gòu)外部的親水性基團都相應(yīng)減少，使得其表面疏水性增強［17］?？v向上，在各溫度條件下，經(jīng)改性后的樣品均較SPI原粉有極顯著(P＜0.01)的提高。上述這些變化說明，用磷酸化對SPI進行改性，可以極大地提高產(chǎn)品的疏水性，增強其與脂肪結(jié)合的能力，從而為其乳化性的提高提供了理論依據(jù)。

圖2 磷酸化改性前后SPI在不同pH值(a)和不同溫度(b)溶液中疏水性的變化

2.4.2 紅外光譜分析

圖3的紅外圖譜顯示，經(jīng)磷酸化改性后的蛋白樣品與SPI原粉相比，只有部分吸收峰發(fā)生了變化，表明磷酸化只是對某些特殊的氨基酸殘基起作用，對于大多數(shù)的氨基酸殘基沒有影響。經(jīng)磷酸化化處理的樣品在900cm－1處產(chǎn)生一個尖銳的峰，而PO43－的吸收峰位于1 120～940cm－1，峰值強且范圍寬［18］，因此可以推斷900cm－1處的吸收峰是PO43－產(chǎn)生的。另外，據(jù)查找P－N在560～390cm－1有吸收，改性后的樣品在538cm－1處有強列的吸收峰，由此可以認為改性后的蛋白分子中新增加了磷酸根，并且這一磷酸根是連接在氮原子上的，磷酸化反應(yīng)的實質(zhì)是賴氨酸活性基團 ε-NH2的氨基磷酸酯化，這 Motohiko［19］、Ferrel［20］等人的研究結(jié)果一致。

圖3 SPI改性前后的紅外圖譜

2.4.3 掃描電鏡

對SPI原粉和磷酸化改性后SPI產(chǎn)品，使用掃描電鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果見圖4。

圖4 SPI原粉與磷酸化改性SPI電鏡掃描圖

從圖4中可以看出，在相同放大倍數(shù)(900倍)下，未經(jīng)改性的SPI原粉顆粒較為規(guī)整，顆粒表面褶皺較淺，平均粒徑較大。經(jīng)過磷酸化改性后的蛋白顆粒整體外觀與原粉類似，但顆粒表面有較深的褶皺與明顯的脊，平均粒徑變小，呈收縮狀。這可能是由于磷酸化改性過程使包埋在蛋白分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團暴露，分子柔性增強。這有利于蛋白分子在界面上的伸展與變形，從而在微觀結(jié)構(gòu)上解釋了改性后SPI乳化性質(zhì)增強的緣故。

3 結(jié)論

(1)通過正交試驗設(shè)計確定磷酸化改性提高大豆分離蛋白乳化性的最適工藝參數(shù)為:SPI濃度13%，STP添加量10%，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間3.5 h。4個反應(yīng)條件對乳化活性與乳化穩(wěn)定性影響的大小次序為:STP添加量＞SPI濃度＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度。在最適工藝條件下，經(jīng)磷酸化改性后的SPI產(chǎn)品的乳化活性從0.293提高到0.785，乳化穩(wěn)定性從17.8 min提高到26.2 min，分別提高了168%和47%。表明采用磷酸化對大豆分離蛋白進行改性，提高蛋白產(chǎn)品乳化性的方法是切實可行的，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

(2)通過對磷酸化改性前后的蛋白樣品進行疏水性、紅外光譜和電鏡掃描(SEM)等3方面的分析測定，確認了STP對SPI的磷酸化反應(yīng)導(dǎo)致其性質(zhì)發(fā)生變化。分析結(jié)果表明:磷酸化作用使改性后SPI的疏水性得到極顯著提高;紅外光譜分析表明磷酸化反應(yīng)的實質(zhì)是賴氨酸活性基團ε-NH2的氨基磷酸酯化反應(yīng);SEM分析認為經(jīng)過改性蛋白樣品顆粒表面有較深的褶皺與明顯的脊，平均粒徑變小，呈收縮狀，從微觀結(jié)構(gòu)上解釋了改性后SPI乳化性質(zhì)增強的緣故。

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Optimization of Technology for Improving Emulsifying Properties of Soybean Protein Isolate and Analysis Its Properties

Chen Jun-gao1，Chi Yu-jie1，2，Wang Xi-bo1，Yu Cui1
1(College of food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)2(Education Ministry＇s and Provincial Key Laboratory of Soybean Biology，Harbin 150030，China)

Soybean protein isolate(SPI)was modified by Sodium tripolyphosphate.Phosphorylation reaction conditions were optimized by the orthogonal experiment design and SPSS analysis software.Hydrophobicity determination，F(xiàn)T-IR Spectrum analysis and scanning electron microscope(SEM)analysis were conducted to confirm the phosphorylation of SPI by STP.The results showed that the order of the influence of the four factors on emulsifying properties was:the addition level of STP，the concentration of SPI，reaction time and temperature.The optimal phosphorylation reaction conditions were as follows:the concentration of SPI 13%，the addition level of STP 10%，temperature 40℃ and reaction time 3.5h.Under the optimum conditions，the emulsification activity of SPI modified by phosphorylation was increased from 0.293 to 0.785.Meanwhile，the Emulsification Stability was increased from 17.8 to 26.2.The optimal technology parameters have an instructive significance for the production of SPI with better emulsifying properties.

soybean protein isolate，phosphorylation，emulsifying properties，technology，property

碩士研究生(遲玉杰教授為通訊作者)。

*國家“十一·五”863計劃項目(2006AA10Z322);黑龍江省自然科學(xué)基金重點項目(ZD200902)

2010－07－19，改回日期:2010－09－15