雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法測定酵母核酸水解的4種核苷酸*

張一平，華洵璐，孫梅，謝駿，匡群，何義進

1(中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫，214081)2(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063)

雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法測定酵母核酸水解的4種核苷酸*

張一平1，2，華洵璐1，2，孫梅1，2，謝駿1，匡群1，2，何義進1

1(中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫，214081)2(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063)

建立了酵母核酸水解率簡便、準確、低成本測定方法。采用雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法同時測定酵母核酸水解的4種單體核苷酸;采用變異系數(shù)(CV)和平均回收率分析該測定方法的精密度和準確度。結(jié)果表明，10%醋酸電泳結(jié)合飽和硫酸銨∶1mol/L醋酸銨∶異丙醇(體積比，80∶18∶2)的展層劑，能同時分離4種核苷酸;測定相關(guān)系數(shù)R均大于0.985;測定核苷酸標準品混合液的變異系數(shù)分別為AMP 1.30%、GMP 1.44%、CMP 1.36%、UMP 1.31%;測定酵母RNA水解液對應的變異系數(shù)分別為2.45%、2.01%、2.75%、2.06%;回收率在94.80%～106.57%，最低檢出限在0.65～0.72mg/mL。

核酸，核苷酸，紙層析，紙電泳

核酸RNA是重要的生物大分子，在生物體的遺傳變異、生長發(fā)育以及蛋白質(zhì)合成中起著重要作用［1］。核酸用5’-磷酸二酯酶催化水解，控制反應條件，可獲得腺苷酸(AMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)4種小分子的單體核苷酸［2］。核苷酸是一類具有重要生理功能的物質(zhì)［3］，廣泛應用于醫(yī)藥、食品工業(yè)［4］，農(nóng)業(yè)上可作為植物生長促進劑［5］，飼料上可用作安全高效的添加劑［6］，尤其對于能耐受較高劑量核苷酸的水生動物效果更明顯［7－8］。

啤酒廢酵母是啤酒工業(yè)主要副產(chǎn)物，其中RNA含量為6%～8%，是生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)品的絕好原料［9］。近年來綜合利用啤酒廢酵母提取核苷酸的研究越來越多，促進了對核酸水解產(chǎn)物核苷酸分析方法的研究。

目前國內(nèi)外測定核苷酸的方法，主要分為反相高效液相色譜法［10－11］、高效毛細管電泳法［12－13］和離子交換液相色譜法［14－15］。反相高效液相色譜法具有快速、準確的優(yōu)點，但分離的核苷酸種類有限，如果要分離核苷酸種類較多的樣品，必須采用繁瑣的梯度洗脫法，因此該方法具有一定的局限性。高效毛細管電泳法具有很高的分離效率，能將各種核苷酸很好地分離，具有快速、污染小的特點，但目前所用儀器主要靠進口，價格昂貴，使用受到一定條件的限制。離子交換色譜法具有較高的分離效率，尤其對于核苷酸、氨基酸這些生物體中的兼性離子化合物，能很好地將其分離，但需要對分離柱進行平衡(再生)，分析時間比較長，主要用于生物學、醫(yī)學和食品等的分析［16］。

以上方法的共同缺陷是操作復雜、測定成本高。本論文根據(jù)酵母RNA降解產(chǎn)物的復雜程度，針對核苷酸的帶電量以及分子量差異的特點，對分離4種核苷酸的電泳系統(tǒng)和層析溶劑進行篩選試驗，采用紙電泳—紙層析結(jié)合法同時分離測定4種核苷酸。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麥芽根:購自中糧麥芽(江陰)有限公司。酵母RNA:用啤酒廢酵母自制，RNA純度90%。蒸餾水:購自無錫華晶飄之霖有限公司。

1.1.2 主要試劑和標準品

冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、異戊醇、異丁醇、異丙醇、吡啶、95% 乙醇、硼砂、硼酸、NaCo3、NaHCo3、醋酸鈉、醋酸銨、HCl、(NH4)2SO4、ZnSO4、MgSO4:均為分析純，國藥上?；瘜W試劑公司。AMP、GMP、UMP、CMP標準品:均為生化試劑級，購自Sigma公司。

濾紙:采用國產(chǎn)新華1號，長30cm，寬15cm。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

AE-100電子分析天平(0.000 1 g)、DYY-6C型電泳儀、TDL-40B臺式低速離心機、751紫外分光光度計、紫外顯色儀、層析缸。

1.2 方法

1.2.1 紙電泳緩沖液

緩沖液Ⅰ:10%醋酸;緩沖液Ⅱ:0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5);緩沖液Ⅲ:0.2mol/L乙酸-乙酸鈉(pH值5.0);緩沖液Ⅳ:0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉(pH值10.8)緩沖液Ⅴ:0.2mol/L硼酸-硼砂(pH值9.0)

1.2.2 紙層析溶劑系統(tǒng)

溶劑系統(tǒng)Ⅰ:V(異戊醇)∶V(5%檸檬酸鈉)=1∶1;溶劑系統(tǒng)Ⅱ:V(異丁醇)∶V(吡啶)∶V(醋酸)∶V(水)=12∶6∶1∶4;溶劑系統(tǒng)Ⅲ:V(95% 乙醇)∶V(醋酸鈉)=7∶3(用醋酸調(diào)pH 5.0)溶劑系統(tǒng)Ⅳ:V(異丁醇)∶V(15N 硫酸銨)∶V(0.1mol/L 硼酸)=6∶1∶3;溶劑系統(tǒng)Ⅴ:V(飽和硫酸銨)∶V(1mol/L醋酸銨)∶V(異丙醇)=80∶18∶2。

1.2.3 標準曲線的建立方法

精確稱取UMP標準品1 g，溶解于50mL蒸餾水中;分別吸取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL 于 10mL容量瓶中，定容，對應的濃度分別為 6、8、10、12、14mg/mL。各標準溶液分別走紙電泳(點樣量5μL，電泳2 h，電壓500 V)。電泳結(jié)束后，晾干;逆時針旋轉(zhuǎn)90°后，放于層析缸中走紙層析8 h。

將層析紙晾干或烘干后，紫外儀(波長2537A)下觀看層析斑。將斑點剪下，用5mL的0.1mol/L HCl浸提3 h(每隔15 min振搖1次);4 000 r/min離心10 min，取上清液紫外分光光度計測定紫外吸收值，0.1mol/L HCl為參比對照。以O(shè)D值為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制UMP標準曲線。

AMP、GMP、CMP標準曲線的建立與UMP相同，只是改用蒸餾水作為浸提液。

1.2.4 核苷酸混合液的制備

標準品混合液:精確稱取 AMP、GMP、UMP、CMP標準品各2.5 g，一起溶解于100mL蒸餾水中，每種核苷酸的濃度均為25mg/mL。

已知濃度的核苷酸混合液:從酵母RNA酶解、純化制得，含 AMP 8.72mg/mL、GMP 9.67mg/mL、UMP 6.80mg/mL、CMP 8.10mg/mL。

1.2.5 酵母核酸RNA水解樣的制備

將新鮮、干燥的麥芽根30 g，粉碎，過80目篩;加入300mL水，攪拌;置4℃冰箱浸泡18 h;4層紗布過濾，濾液4 000 r/min離心5 min;上清液70℃水浴5 min滅雜酶后，即為5’-磷酸二酯酶粗酶液。稱取80 g酵母RNA，溶解于1 200mL水中;2mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH7.0，加入 0.2mol/L 的 MgSO4、10－3mol/L 的ZnSO4，然后倒入粗酶液;70℃水浴攪拌反應2 h;升溫至90℃滅酶5 min。測定水解液中4種核苷酸的含量。

1.2.6 測定誤差分析方法

精密度的高低用變異系數(shù)(CV)表示、準確度用平均加標回收率表示;包括標準偏差(S)、最低檢出限(DL)等的計算公式參見文獻［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種單體核苷酸在不同紙電泳系統(tǒng)中的遷移效果

將濃度為10mg/mL的核苷酸標準品溶液分別點樣至不同緩沖液中，電泳2 h，電壓500 V，結(jié)果見表1。

表1 四種核苷酸在不同電泳緩沖液中的遷移距離

由表1可知，只有10%的醋酸和乙酸-乙酸鈉緩沖液能將GMP和UMP單獨地分離出來;而其他3種緩沖液只能分離出1種核苷酸。考慮到配制溶液的方便性，選擇10%醋酸作為電泳緩沖液。

2.2 4種單體核苷酸在雙向紙電泳-紙層極系統(tǒng)中的分離效果

由于AMP和CMP在10%醋酸電泳液中遷移距離相近，不能單獨分開，所以必須尋找一種能將兩者分開的溶劑系統(tǒng)。本論文將濃度為10mg/mL的核苷酸標準品溶液分別先在10%醋酸電泳液中走紙電泳，然后逆時針旋轉(zhuǎn)90°，再在不同的溶劑系統(tǒng)中走紙層析(層析8 h)，結(jié)果見表2。

表2 四種核苷酸先10%醋酸紙電泳-再紙層析的Rf值

由表2可知，溶劑系統(tǒng)(V)其AMP與CMP的Rf值相差最大，所以選擇該溶劑作為電泳后的紙層析溶劑系統(tǒng)。

2.3 雙向紙電泳-紙層析系統(tǒng)對四種核苷酸混合液的分離效果影響

以上實驗均是將單獨的核苷酸點樣后的結(jié)果，為了更進一步確定該紙電泳-紙層析系統(tǒng)同時分離4種核苷酸的效果，取濃度各為25mg/mL的標準品混合液，先走紙電泳，然后逆時針旋轉(zhuǎn)90°，再走紙層析，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 四種核苷酸混合液在10%醋酸電泳液中的電泳結(jié)果

圖2 四種核苷酸混合液在溶劑系統(tǒng)(V)中的層析結(jié)果

從圖1可知，4種核苷酸的混合液，經(jīng)10%醋酸電泳后，能清楚地分離出 GMP和 UMP，最上面是UMP斑點、中間是GMP斑點，而最下面的是AMP和CMP的混合點。

從圖2可知，4種核苷酸的混合液先走紙電泳，再走紙層析，能將AMP和CMP有效地分開，CMP的位置在AMP的正上方，且距離相差很大。

2.4 雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法測定4種核苷酸標準曲線的建立

先以10%醋酸電泳系統(tǒng)，再以V(飽和硫酸銨)∶V(1M 醋酸銨)∶V(異丙醇)=80∶18∶2 為紙層析溶劑系統(tǒng)，按照1.2.3小節(jié)的描述，分別建立4種核苷酸的測定用標準曲線，結(jié)果見圖3－圖6。

圖3 AMP標準曲線

圖4 GMP標準曲線

圖5 UMP標準曲線

圖6 CMP標準曲線

由上圖3～圖6可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，紫外吸收值(OD值)與濃度呈良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R均在0.985以上，表明OD值與濃度之間有較精確的相互關(guān)系。由此得出“雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”測定核苷酸的計算公式為:

AMP含量(mg/mL)=1/0.034×OD259×稀釋倍數(shù)=29.41×OD259×稀釋倍數(shù)

GMP含量(mg/mL)=1/0.017×OD262.5×稀釋倍數(shù)=58.82×OD262.5×稀釋倍數(shù)

CMP含量(mg/mL)=1/0.016×OD260×稀釋倍數(shù)=62.50×OD260×稀釋倍數(shù)

UMP含量(mg/mL)=1/0.020×OD262×稀釋倍數(shù)=50.00×OD262×稀釋倍數(shù)

2.5 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”的精密度測定

按照1.2.4小節(jié)的描述，配制核苷酸標準品混合液1份(每種核苷酸的濃度均為25mg/mL)，在同一天連續(xù)進行5次測定，結(jié)果見表3。

表3 “雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法”的精密度結(jié)果

從表3可知，4種核苷酸的變異系數(shù)CV均≤2.0%，表明該方法測定的精密度結(jié)果符合分析要求。以2倍信噪比計算的 AMP、GMP、CMP、UMP的最低檢出限分別為 0.65、0.72、0.68、0.65mg/mL。

2.6 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”的準確度測定

取已知濃度的核苷酸混合液1份，加入不同質(zhì)量濃度的標準品混合液，制備成高(約20mg/mL)、中(約15mg/mL)、低(約10mg/mL)3個濃度的混合液，測定3次求平均值，計算平均回收率，結(jié)果見表4。

表4 “雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法”的回收率測定結(jié)果

由表4可知，AMP的回收率在 95.20%～98.62%、GMP的回收率在 101.46%～106.57%、CMP的的回收率在94.80%～96.92%、UMP的回收率在98.43%～100.40%，回收率達到理想效果，表明該方法具有較高的準確度，完全可以用于核酸水解率的測定。

2.7 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”測定酵母核酸RNA水解樣中四種核苷酸的含量

按照1.2.5小節(jié)的描述，制備酵母核酸RNA酶水解液共5個批次，測定樣液中的核苷酸含量，結(jié)果見表5。

表5 磷酸二酯酶水解酵母核酸RNA樣液中四種核苷酸的測定結(jié)果

從表5可知，5個批次酵母核酸RNA水解樣的測定結(jié)果表明，4種核苷酸的變異系數(shù)在2.01%～2.75%，數(shù)據(jù)的重復性仍舊較好，其精密度仍在儀器分析要求之內(nèi)，可以滿足酵母核酸水解率測定的需要。

3 討論

盡管我國的國家標準與行業(yè)標準有肌苷酸和鳥苷酸的檢測方法［18～19］，但由于酵母核酸RNA水解產(chǎn)物的復雜性，4種單體核苷酸混合在一起，且僅是產(chǎn)物的一部分，因此無法直接引用這些標準進行檢測。目前采用的高效液相色譜等方法，需要通過梯度洗脫分離出純核苷酸才能檢測，操作非常復雜，且儀器設(shè)備要求高，測定成本高。而如果單純采用紙電泳法或紙層析法，卻無法找到一種溶劑系統(tǒng)能同時分離這4種核苷酸。

本論文針對上述難題，首先對核苷酸的紙電泳系統(tǒng)和紙層析展開劑進行了大量篩選實驗，最終尋找到了一種紙電泳和紙層析結(jié)合系統(tǒng)能將四種核苷酸完全地分開，從而建立了一種新的酵母核酸水解產(chǎn)物測定方法。對于核苷酸標準品混合液以及酵母核酸RNA水解液，該測定方法5次重復測定的變異系數(shù)分別在1.30%～1.44%和2.01%～2.75%，最低檢出限 0.65～0.72mg/mL，準確度 94.80% ～106.57%，表明其精密度和準確度結(jié)果與高效液色譜等方法相近［10－16］。

本論文建立的測定方法最大優(yōu)點是操作簡單、儀器要求不高、測定成本低，可一次性同時測定出4種核苷酸的含量。

在采用酵母細胞生產(chǎn)核苷酸的工藝過程中，急需建立一種簡單、準確、廉價的分析定量方法進行生產(chǎn)過程監(jiān)控和產(chǎn)品質(zhì)量控制，本論文建立的測定方法具有實際應用意義。對于保健品、食品、食用菌等產(chǎn)品中的核苷酸檢測，該方法也具有一定的推廣價值。

［1］李建武.生物化學［M］.北京:北京大學出版社，1990，79－92.

［2］蘇慶輝，吳曉丹，馬興勝，等.啤酒酵母中核苷酸的提取研究［J］. 釀酒，2004，31(3):30－32.

［3］馮芳，趙祥穎，劉建軍.核苷酸對機體作用及開發(fā)利用前景/全國第三屆功能性生物制品生產(chǎn)與應用技術(shù)交流會論文集［C］.出版地:新疆，2008:315－318.

［4］應國清，石陸娥，唐振興.核苷酸類物質(zhì)的應用研究進展［J］.廣州食品工業(yè)科技，2004，20(2):126－128.

［5］吳振強，李珊，羅寧.農(nóng)用核苷酸的開發(fā)進展［J］.土壤肥料，2004(4):3－6.

［6］宋春玲，計成，王永杰.外源核苷酸在畜禽生產(chǎn)中的營養(yǎng)研究進展［J］.營養(yǎng)與飼養(yǎng)，2005，32(1):10－13.

［7］孟現(xiàn)成，邵慶均.外源核苷酸在魚類飼糧中的應用［J］.中國飼料，2007(2):39－42.

［8］Burrells Charles，William Paul Darvid.Dietary Nucleotides:a novel supplement in fish feeds 1.Effects on resistance to diseases in salmonids［J］.Aquaculture，2001，199:159－169.

［9］丁滿生，李績，肖冬光.啤酒酵母泥回收利用研究動態(tài)［J］. 釀酒科技，2001，106(4):73－75.

［10］田寶勇，趙星潔.啤酒酵母RNA降解產(chǎn)物5，-核苷酸的高效液相色譜分析［J］.釀酒科技，2008，165(3):97－99.

［11］王曉麗，鄭飛云，李永仙，等.反相高效液相色譜法測定酵母RNA降解的5’-核苷酸［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(6):130～131.

［12］韓鳳梅，楊新，陳勇.四種單核苷酸的毛細管區(qū)帶電泳分離分析［J］.湖北大學學報:自然科學版，1999，21(2):161－163.

［13］趙星潔，劉英華.毛細管電泳分離啤酒廢酵母中4種5-核苷酸［J］. 中國釀造，2007，173(8):68～71.

［14］李意.離子交換色譜法測定小球藻提取物中的核苷酸［J］. 分析化學研究簡報，2004，32(8):1 077－1 079.

［15］Brendon D G，Harvey E I.Development and application of a liquid chromatographic method for analysis of nucleotide and nucleosides in milk and infant formulas［J］.International Dairy Journal，2007(17):596－605.

［16］張燕婉，魯紅軍，王津生.高效液相色譜法測定食品中核苷酸的含量［J］. 食品科學，1994，174(6):59～62.

［17］王興國.理化檢驗與數(shù)理統(tǒng)計［M］.鄭州:河南科學技術(shù)出版社，1994:7－18.

［18］QB/T8967－2007.谷氨酸鈉(味精)［S］.

［19］QB/T2846－2007.食品添加劑5－鳥苷酸二鈉［S］.

Determination of Four Nucleotides from Yeast RNA Hydrolysate Combined the Methods of Paper Electrophoresis and Paper Chromatography

Zhang Yi-ping1，2，Hua Xun-lu1，2，Sun Mei1，2，Xie Jun1，Kuang Qun1，2，He Yi-jin1
1(Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Science，Wuxi 214081，China)2(Jiangsu limited company of Suwei microbiology，Wuxi 214063，China)

To establish the simple，accurate and inexpensive determination method of yeast RNA hydrolyzed yield.Method:The four single nucleotides of RNA hydrolysate were determined by the combined methods of paper electrophoresis and paper chromatography;the precision and accuracy of this method were analyzed using coefficient of cariation(CV)and average recovery .Result:Combined the 10%acetic acid buffer and the saturated(NH4)2SO4∶1M ammonium acetate∶isopropanol(80∶18∶2，V/V);developing solvent，the four single nucleotides could be separated simultaneously;the relative coefficient(R)were all more than 0.985;the CV value of AMP，GMP，CMP，UMP was 1.30%，1.44%，1.36%and 1.30%respectively in the standard nucleotides mixture sample，while the CV value was 2.45%，2.01%，2.75%and 2.06%respectively in the yeast RNA hydrolization liquid;the average ratio of recovery were between 94.80%and 106.57%;the minimum detection limit were between 0.65～0.72mg/mL.Conclusion:The determination method deployed in this paper had the advantages of meticulous precision，high degree of accuracy，lower investment of instrument and cheaper cost，so it can be promoted widely.

nucleic acid，nucleotides，paper electrophoresis，paper chromatography

學士，副研究員。

*農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室開放基金資助項目:新型安全高效水產(chǎn)飼料添加劑——酵母核苷酸的研究開發(fā)(BZ2009);2008農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目:生態(tài)高效規(guī)范化淡水養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)示范(2008GB2C100110)。

2010－04－27