響應面法優(yōu)化海藻酸鈉-淀粉固定化蒜氨酸酶

曹 陽，相姝楠，甘芝霖，劉 萍，胡雪芳，李淑燕，陳芹芹，姜 莎，倪元穎

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，農業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

響應面法優(yōu)化海藻酸鈉-淀粉固定化蒜氨酸酶

曹 陽，相姝楠，甘芝霖，劉 萍，胡雪芳，李淑燕，陳芹芹，姜 莎，倪元穎*

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，農業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

探討了海藻酸鈉-淀粉固定化蒜氨酸酶技術，對影響固定化酶酶活回收率和硬度的因素進行了研究，并利用響應面法對固定化酶工藝進行優(yōu)化。結果表明，固定化酶的酶活回收率和硬度受刀豆球蛋白A濃度、海藻酸鈉濃度和氯化鈣濃度的影響較為顯著，所得到優(yōu)化條件為：刀豆球蛋白濃度1.02mg/mL，海藻酸鈉濃度2.25%，氯化鈣濃度2.22%，由此得到的固定化酶的酶活回收率可達78.15%，硬度為2076.69g。

海藻酸鈉，淀粉，刀豆球蛋白A，蒜氨酸酶，固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮、無病蟲害、充分成熟的紫皮洋蔥 市售，4℃儲存?zhèn)溆?；海藻酸鈉、淀粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；刀豆球蛋白A sigma公司；底物實驗室自制［10］；其它試劑 均為分析純。

食物調理機 德國BROWN公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-!型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；Hitachi Himac CR22g高速冷凍離心機 日本日立株式會社；S22-2磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；1mL注射器 常州悅康醫(yī)療器材有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏精密實驗設備有限公司；TA-XT2i物性測試儀 英國 Stable Micro System公司；UV757CRT紫外可見分光光度計普析通用。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒜氨酸酶粗酶液的提取 稱取1kg新鮮的去皮洋蔥鱗莖，在4℃冰柜中預冷4h。取出后將每個洋蔥切成4塊，與2L Tris-HCl緩沖液混合，用高速組織搗碎機破碎，之后用6層紗布過濾，濾液于冷凍離心機中離心去除殘渣。取上清液，首先加入最終飽和濃度為30%的硫酸銨沉淀除去雜蛋白，離心后取上清液再加入終濃度為65%的硫酸銨鹽析，離心后得到的白色沉淀即為蒜氨酸酶。再用緩沖液將其溶解，之后進行高速冷凍離心，過濾除去沉淀及雜質，將得到的酶液裝入截流分子量為8000～12000的透析袋除鹽，得到蒜氨酸酶粗提液，此過程均在0～4℃下完成［11］。

1.2.2 蒜氨酸酶的固定化 稱取一定量的刀豆球蛋白A，加入到10mL經1.2.1制得的酶液，再加入一定量的海藻酸鈉和淀粉，充分攪拌均勻。用1mL注射器吸取上述溶膠，逐滴滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，使之成為大小均一的球狀凝膠珠，再將形成的凝膠珠置于該氯化鈣溶液中于4℃的冰箱中硬化6h。然后將抽濾所得的硬化凝膠珠，用緩沖液洗滌以除去殘留的蛋白和氯化鈣，得到直徑2.0mm左右的球狀固定化蒜氨酸酶，于4℃的冰箱中備用。

1.2.3 單因素實驗 通過預實驗可知，添加淀粉可以減小凝膠珠的溶脹，并可增加凝膠珠的硬度。而淀粉的添加量對酶活回收率并無顯著性影響，因而本實驗將淀粉的濃度固定在2.25%（w/v）。

1.2.3.1 刀豆球蛋白A濃度對酶活回收率和硬度的影響 在其它條件恒定（2%海藻酸鈉、2%氯化鈣）時，按照1.2.2中的方法用0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL的刀豆球蛋白A制成固定化酶，測定固定化酶的酶活回收率和硬度。

1.2.3.2 海藻酸鈉濃度對酶活回收率和硬度的影響

在其它條件恒定（1.0mg/mL刀豆球蛋白A、2%氯化鈣）時，按照1.2.2中的方法用1%、1.5%、2%、 2.5%、3%（w/v）的海藻酸鈉制成固定化酶，測定固定化酶的酶活回收率和硬度。

1.2.3.3 氯化鈣濃度對酶活回收率和硬度的影響在其它條件恒定（1.0mg/mL刀豆球蛋白A、2%海藻酸鈉）時，按照1.2.2中的方法將溶膠滴入1%、2%、3%、4%、5%（w/v）的氯化鈣溶液中制成固定化酶，測定固定化酶的酶活回收率和硬度。

1.2.4 優(yōu)化實驗設計 依據Design Expert軟件，采用Central Composite Design建立數學模型，以海藻酸鈉濃度X1、刀豆球蛋白A濃度X2和氯化鈣濃度X3三個因子為自變量，按方程xi=（Xi-Xo）/△X對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，Xo為實驗中心點處自變量的真實值，△X為自變量的變化步長。以酶活回收率和硬度為響應值，建立回歸方程模型。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 丙酮酸鈉標準曲線的制作 準確稱取110mg丙酮酸鈉，溶解后定容于100mL容量瓶，制成0.01mol/L丙酮酸鈉溶液。取5只100mL容量瓶分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL丙酮酸鈉，用蒸餾水定容。分別從各容量瓶中吸取4mL丙酮酸鈉溶液加入5只試管中，然后各管分別加入1mL、0.005mol/L的2，4-二硝基苯肼溶液，于25℃下反應5min；再加入5mL、1.0mol/L的NaOH溶液，于25℃下反應10min，最后在420nm處測定各管吸光度值（空白以蒸餾水代替丙酮酸溶液），依據各吸光度值及對應的丙酮酸含量繪制標準曲線。

圖1 丙酮酸鈉標準曲線

其標準曲線回歸方程為：y=0.0031+0.01257x，R2=0.9996。其中：y-吸光度，x-酶活力（U）。

1.2.5.2 酶活測定方法 酶活力定義：35℃條件下，每分鐘產生1"g丙酮酸定義為一個酶活單位（U）。

游離酶活力的測定按文獻［12］中的方法改進后進行，即向試管中加入500"L底物，再加入500"L酶液，35℃反應后加入1mL、10%三氯乙酸以終止反應，再加入0.5mL的2，4-二硝基苯肼反應5min，之后加入 2.5mL 1.0mol/L氫氧化鈉反應 10min，于420nm波長處進行比色測定吸光值。

固定化酶活力的測定以一定量的固定化酶代替游離自由酶，按游離酶活力測定方法測定。

1.2.5.3 酶活力回收率計算

酶活回收率（%）=固定化酶總活力/用于固定化的酶的總活力×100%

1.2.5.4 固定化酶硬度的測定 隨機取5粒固定化酶，采用物性測試儀測定其硬度。主要參數設定為：SM SP/36R圓柱型探頭；測試前、中、后速度分別為5.0、2.0、5.0mm/s；測定形變限 80%；記錄速率200pps；力量感元20g。固定化酶硬度以應力-應變（時間）曲線最大峰值（g）表示。

表2 響應面分析實驗設計及結果

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 刀豆球蛋白A濃度對酶活回收率和硬度的影響 圖2結果表明，當刀豆蛋白A濃度為1.0mg/mL時，所得固定化酶的酶活回收率最高，達到72.29%。當刀豆球蛋白A濃度小于1.0mg/mL時，隨著刀豆球蛋白A的濃度增高，酶活回收率逐漸增高；當刀豆球蛋白A濃度大于1.0mg/mL時，隨著刀豆球蛋白A的濃度增高，酶活回收率逐漸下降。由多重比較發(fā)現(xiàn)，各點之間的酶活回收率差異顯著。隨著刀豆球蛋白A濃度的改變，固定化酶硬度之間的差異不顯著。

圖2 刀豆球蛋白A濃度對酶活回收率和硬度的影響

2.1.2 海藻酸鈉濃度對酶活回收率和硬度的影響圖3結果表明，當海藻酸鈉濃度小于2.5%時，酶活回收率隨著海藻酸鈉的濃度增大而增大，而當海藻酸鈉濃度大于2.5%時，酶活回收率由于凝膠珠過于致密等原因而呈現(xiàn)下降的趨勢。由多重比較發(fā)現(xiàn)，酶活回收率在海藻酸鈉濃度為2.0%與2.5%時不存在顯著性差異，其余均存在顯著性差異。海藻酸鈉濃度在1%～3%范圍內，隨著海藻酸鈉濃度升高，固定化酶珠硬度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，且由多重比較發(fā)現(xiàn)各點之間均存在顯著性差異。

圖3 海藻酸鈉濃度對酶活回收率和硬度的影響

2.1.3 氯化鈣濃度對酶活回收率和硬度的影響 圖4結果表明，當氯化鈉濃度為2%時，所得固定化酶的酶活回收率最高，達到72.37%。當氯化鈉濃度小于2%時，隨著氯化鈉濃度增高酶活回收率增高；當氯化鈉濃度大于2%時，隨著氯化鈉濃度增高酶活回收率逐漸下降。氯化鈣濃度在1%～5%范圍內，隨著氯化鈣濃度的升高，固定化酶的硬度逐漸增大。

圖4 氯化鈣濃度對酶活回收率和硬度的影響

2.2 響應面法優(yōu)化固定化酶工藝

2.2.1 響應面法因素與水平的選擇 根據單因素實驗結果，采用三因素五水平的響應面法，實驗因子編碼及水平見表1。

表1 響應面三因素五水平實驗設計

2.2.2 響應面法實驗設計及結果 表2中給出了固定化酶的酶活回收率和硬度的實驗結果。

按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對實驗設計各組的酶活回收率進行回歸分析，得回歸方程為：

式中：Y1為固定化酶的酶活回收率；x1、x2、x3分別為上述3個自變量的編碼值。

對模型進行方差分析，見表3。本實驗所選模型的F值是54.40（＜0.0001），表明不同處理間差異極顯著。失擬項P=0.4812＞0.05，失擬項差異不顯著，表明該方程對實驗擬合程度好，實驗誤差小。該模型相關系數是0.9839，校正決定系數是0.9658，說明該模型能解釋96.58%響應值變化，僅有3.42%的變異不能用此模型解釋；它和校正決定系數接近，表明此模型是合適的。對模型進行模型系數顯著性檢驗，見表4。回歸模型的常數項極顯著，一次項x1、 x2、x3極顯著，二次項極顯著，交互項x2x3顯著，其余不顯著。依據三個一次項回歸系數絕對值的大小可知，因素的主效應關系為：氯化鈣濃度＞刀豆球蛋白濃度＞海藻酸鈉濃度。

表3 回歸模型方差分析表

按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對實驗設計各組的硬度進行回歸分析。結果表明，線性模型較二次回歸模型更適宜于描述各自變量對實驗結果的影響規(guī)律，經優(yōu)化所得的線性回歸方程為：

式中：Y2為固定化酶的硬度；x1、x2、x3分別為上述3個自變量的編碼值。

表4 回歸方程模型系數的顯著性檢驗

該模型相關系數是0.9328；校正決定系數是0.9185，說明該模型能解釋91.85%響應值變化，僅有8.15%的變異不能用此模型解釋；說明此模型能夠充分描述各實驗因素對實驗指標的影響規(guī)律。依據三個一次項回歸系數絕對值的大小可知因素的主效應關系為：海藻酸鈉濃度＞氯化鈣濃度＞刀豆球蛋白濃度。

2.2.3 響應面法分析與優(yōu)化

2.2.3.1 酶活回收率的分析 根據模型的回歸方程，固定一個因素在編碼值0的水平，分析另外兩個因素對酶活回收的影響，Design Expert軟件生成3個三維響應面（圖5～圖7）。

圖5 海藻酸鈉濃度和刀豆球蛋白A濃度的響應面

圖6 氯化鈣濃度和刀豆球蛋白A濃度的響應面

圖7 氯化鈣濃度和海藻酸鈉濃度的響應面

從圖5可以看出，氯化鈣濃度在2%時，海藻酸鈉濃度和刀豆球蛋白濃度對酶活回收率的影響。當海藻酸鈉濃度不變時，隨著刀豆球蛋白濃度的升高，酶活回收率先升高后降低；當刀豆球蛋白濃度不變時，隨著海藻酸鈉濃度的升高，酶活回收率呈現(xiàn)同樣的變化趨勢。酶活回收率的變化速率顯示刀豆球蛋白濃度的主效應大于海藻酸鈉濃度，與統(tǒng)計結果相符。從圖6可以看出，海藻酸鈉濃度在2.25%時，氯化鈣濃度和刀豆球蛋白濃度對酶活回收率的影響。當氯化鈣濃度不變時，隨著刀豆球蛋白濃度的升高，酶活回收率先升高后降低。酶活回收率的變化速率顯示氯化鈣濃度的主效應大于刀豆球蛋白濃度，與統(tǒng)計結果相符。從圖7可以看出，刀豆球蛋白濃度在1mg/mL時，氯化鈣濃度和海藻酸鈉濃度對酶活回收率的影響。酶活回收率的變化速率顯示氯化鈣濃度的主效應大于海藻酸鈉濃度，與統(tǒng)計結果相符。等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著［13］。比較圖5～圖7等高線可知，氯化鈣濃度和海藻酸鈉濃度的交互作用最為顯著。

2.2.3.2 硬度的分析 根據模型的回歸方程，固定兩個因素在編碼值0的水平，分析另外一個因素對硬度的影響，Design Expert軟件生成3個線性圖（圖8～圖10）。

圖8 刀豆球蛋白A濃度對硬度的影響

圖9 海藻酸鈉濃度對硬度的影響

圖10 氯化鈣濃度對硬度的影響

從圖8可以看出，氯化鈣濃度在2%、海藻酸鈉濃度在2.25%時，刀豆球蛋白濃度對酶活回收率的影響。隨著刀豆球蛋白濃度的升高，硬度變化趨勢不明顯。從圖9可以看出，氯化鈣濃度在2%、刀豆球蛋白濃度在1mg/mL時，海藻酸鈉濃度對硬度的影響。隨著刀豆球蛋白濃度的升高，硬度逐漸上升。從圖10可以看出，刀豆球蛋白濃度在1mg/mL、海藻酸鈉濃度在2.25%時，氯化鈣濃度對硬度的影響。隨著氯化鈣濃度的升高，硬度逐漸上升。從三個圖形的變化速率可以看出，海藻酸鈉濃度的主效應大于氯化鈣濃度，氯化鈣濃度的主效應大于刀豆球蛋白濃度，與統(tǒng)計結果相符。

2.2.3.3 優(yōu)化 由于本實驗的目的是獲得較高的酶活回收率和較好的固定化酶硬度，因此優(yōu)化結果選擇在較高的酶活回收率基礎上有較好的固定化酶硬度。用Design Expert軟件進行優(yōu)化，刀豆球蛋白A濃度、海藻酸鈉濃度和氯化鈣濃度都選擇在本實驗范圍內；酶活回收率的目標選擇最大，重要性選擇+++++，最低值選擇63.7071，最高值選擇78.6058，權重選擇1；硬度的目標選擇最大，重要性選擇+，最低值選擇887.322，最高值選擇2835.93，權重選擇1。

優(yōu)化的結果為：刀豆球蛋白濃度1.02mg/mL，海藻酸鈉濃度2.25%，氯化鈣濃度2.22%。在這個條件下獲得的固定化蒜氨酸酶的酶活回收率為78.15%，同時固定化酶的硬度為2076.69g。

2.2.3.4 驗證實驗 對響應面法優(yōu)化的結果進行驗證，即在刀豆球蛋白濃度1.02mg/mL，海藻酸鈉濃度2.25%，氯化鈣濃度2.22%的條件下，對優(yōu)化實驗結果進行驗證實驗。在此條件下，固定化蒜氨酸酶的酶活回收率為78.23%，硬度為2089.86g，接近且都略高于Design Expert軟件得到的預測值。由此證明實驗模式合理，實驗結果理想。

3 結論

3.1 本實驗利用 Design Expert軟件，采用 Central Composite Design建立酶活回收率回歸模型為：Y1= 77.63+1.88x1-0.86x2+2.03x3+0.52x1x2-0.67x1x3-；硬度回歸模型為：Y2=1930.36-12.89x1+478.88x2+142.45x3，兩個方程擬合程度良好，實驗誤差小。

3.2 利用模型的響應面及其等高線對影響酶活回收率的關鍵因子及其相互作用進行探討，同時對影響硬度的關鍵因子進行了探討，優(yōu)化出了較高的酶活回收率和較好的固定化酶硬度的條件為：刀豆球蛋白濃度1.02mg/mL，海藻酸鈉濃度2.25%，氯化鈣濃度2.22%，所得的固定化蒜氨酸酶的酶活回收率為78.15%，硬度為2076.69g。

3.3 以海藻酸鈉-淀粉為載體固定蒜氨酸酶可以實現(xiàn)酶的反復利用，為蒜氨酸酶的工業(yè)化應用提供了理論依據。將來可對固定化蒜氨酸酶的酶學性質進一步研究，以獲得固定化酶反應最適溫度及最適pH等條件；也可對固定化酶與底物反應產生硫化合物的適宜條件進行探索，使反應朝著對人類有益的方向進行。

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Optimization of the conditions of the alliinase’s immobilization in sodium alginate-starch by response surface methodology

CAO Yang，XIANG Shu-nan，GAN Zhi-lin，LIU Ping，HU Xue-fang，LI Shu-yan，CHEN Qin-qin，JIANG Sha，NI Yuan-ying*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Education Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China）

The technology of alliinase’s immobilization in sodium alginate-starch was discussed.Some factors affecting the enzyme recovery and hardness of immobilized alliinase were investigated，and the process of immobilization was optimized using response surface methodology.The result showed that the enzyme recovery and hardness ofimmobilized alliinase were affected byconcanavalin A concentration，sodium alginate concentration and calcium chloride concentration.The optimum conditions were 1.02mg/mL concanavalin A，2.25% sodium alginate and 2.22%calcium chloride.Finally the enzyme recovery was 78.15%and hardness was 2076.69g.

sodium alginate；starch；concanavalin A；alliinase；immobilization

Q814.2

A

1002-0306（2010）07-0162-06

蒜氨酸酶，全稱為S-烷基-L-半胱氨酸亞砜酶，又稱蒜酶、烷基半胱氨酸亞砜酶、C-S酶等。1949年Stoll和Seebeck首次從大蒜中分離得到蒜氨酸酶［1］。洋蔥中的有機硫化物具有抗菌消炎、抗過敏、抗血栓形成、抗癌和抑制糖尿病等保健功能［2］。當洋蔥組織被破碎或受到機械損傷、細胞壁受到破壞時，無味、非揮發(fā)性的非蛋白含硫氨基酸前體物質S-烴基-L-半胱氨酸亞砜才與蒜氨酸酶接觸形成這類化合物。蒜氨酸酶的應用受游離酶的穩(wěn)定性差的限制，通常情況下固定化酶的穩(wěn)定性有所提高，同時固定化酶容易實現(xiàn)酶和底物、產物的分離，并可在較長時間內進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應［3］。目前有關固定化蒜氨酸酶方面的報道較少，僅有國外少數科學家對其進行了研究［4-5］，國內未見報道。刀豆球蛋白A是從刀豆和豌豆等籽粒中提取而得的一種植物凝集素，為四聚體球蛋白，每個亞基含一個糖結合部位，能與葡萄糖、甘露糖結合。洋蔥中的蒜氨酸酶是一種糖蛋白，其糖鏈上含有葡萄糖和甘露糖［6］。因而，刀豆球蛋白A能與蒜氨酸酶結合。由于刀豆球蛋白A是四聚體蛋白，因而它可與幾個蒜氨酸酶分子同時結合，一方面新形成的物質比游離的蒜氨酸酶空間體積大，從而減少了蒜氨酸酶的泄露；另一方面使固定化酶結合的酶量增多，提高了固定化酶的蛋白偶聯(lián)率。海藻酸鹽溫和的凝膠性能和無毒性，使它成為最廣泛使用的固定化的材料之一［7］。淀粉是高分子量聚合物，可使固定化酶適應不利的外界條件［8-9］，緩解海藻酸鈉凝膠珠遇水溶脹。本文主要研究了刀豆球蛋白A濃度、海藻酸鈉濃度和氯化鈣濃度對酶活回收率和硬度的影響，應用響應面優(yōu)化法確定固定化蒜氨酸酶的適宜工藝參數。

2009-07-24 *通訊聯(lián)系人

曹陽（1985-），女，在讀碩士生，主要從事天然產物提取及食品研發(fā)的研究。

國家自然科學基金資助項目（30871748）。