二十二碳六烯酸海藻糖酯的分離純化及鑒定

孫月娥,夏文水,陳 潔

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

二十二碳六烯酸海藻糖酯的分離純化及鑒定

孫月娥,夏文水,陳 潔＊

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖為原料,通過固定化脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯,并對其分離純化方法進行研究。確定DHA海藻糖酯的薄層層析(TLC)條件：展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水(8.5/1/0.5,v/v/v),碘蒸氣顯色 10min;硅膠柱層析條件：正己烷/異丙醇/甲醇(5/4/1和 4/4/2,v/v/v)梯度洗脫,流速 1.3mL/min,1管/7min收集洗出液;用半制備高效液相色譜(HPLC)進一步純化單酯收集液,經(jīng)分析型 HPLC檢測純度后用核磁共振(NMR)方法進行結(jié)構(gòu)鑒定,確定為DHA藻糖單酯。

二十二碳六烯酸(DHA),海藻糖酯,固定化脂肪酶,純化,核磁共振(NMR)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

硅膠(200～300目)、硅膠板 (G254) 青島海洋化工;甲醇(色譜純) 江蘇漢邦科技有限公司;海藻糖 (食品級) 日本林原公司;DHA乙酯 (含量 ＞75%) 無錫市迅達海洋生物制品廠贈送;4?分子篩、叔丁醇及其它有機溶劑 分析純,中國醫(yī)藥集團上海試劑有限公司;固定化脂肪酶Novozym 435 諾維信公司。

Waters高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Waters半制備型高效液相色譜儀 美國Waters公司;LC20A分析型高效液相色譜儀 日本島津公司;Seastar旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 無錫星海王生化設(shè)備有限公司;水浴恒溫振蕩器 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;BRUKER 500MHz核磁共振儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 非水相酶法合成DHA海藻糖酯 在 250mL圓底燒瓶(包裹錫箔紙)中分別加入150mL預脫水的叔丁醇、1.5g海藻糖、4.24g DHA乙酯、1.5g固定化脂肪酶Novozym 435,充氮保護,在 50℃恒溫水浴振蕩器(150r/min)中避光反應(yīng) 50h。

1.2.2 液質(zhì)聯(lián)用分析(HPLC-MS)

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱,Y MC-Pack ODS-A, 4.6mm×250mm,5μm;流動相 A,超純水 (0.3%甲酸);流動相 B,甲醇;流動相 C,正己烷;梯度洗脫程序：0～15min,A 20%～0%,B 80%～100%;15～30min, B 90%～100%,C 0%～10%。流速,1mL/min;檢測波長,205nm;柱溫,30℃;進樣量 10μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 (MS) Waters Platfor mZ MD 4000,電噴霧離子化源,正離子模式 ES+：毛細管電壓 4.20kV,錐孔電壓 36V,離子源溫度 100℃,脫溶劑氣溫度 250℃,質(zhì)量范圍 (m/z)200～1400,光電倍增器電壓 650V,Analyser真空度 2.6e-5mBar,氣體流速4.3L/h。負離子模式 ES-：毛細管電壓 4.23kV,錐孔電壓 36V,離子源溫度 100℃,脫溶劑氣溫度 250℃,質(zhì)量范圍 (m/z)200～1400,光電倍增器電壓 650V, Analyser真空度 2.6e-5mBar,氣體流速 4.3L/h。

1.2.3 硅膠柱層析分離純化 將反應(yīng)液過濾,除去固定化脂肪酶,減壓濃縮,濃縮液上硅膠層析柱 (硅膠 200～300目,30mm×400mm),流動相為正己烷/異丙醇 /甲醇 =5/4/1、4/4/2(v/v/v)梯度洗脫,流速為 1.3mL/min,按 1管/7min分段收集洗出液,同時進行 TLC檢驗。將斑點相同者用分析型 HPLC進一步檢測,合并雜質(zhì)較少的收集管中的流出物,將其進行減壓濃縮后,用半制備液相色譜進一步分離純化。

1.2.4 薄層色譜(T LC)分析 將經(jīng)過硅膠柱層析收集的粗分離液在硅膠薄層板上點樣,展開劑為乙酸乙酯/甲醇/水 (8.5/1/0.5,v/v/v),展開 10min,碘蒸氣顯色。

1.2.5 半制備液相色譜純化 色譜條件：Sunfire C18色譜柱(150mm×19mm i.d.,10μm),流動相甲醇∶水(v/v)=85∶15,流速 8.0mL/min,檢測波長 205nm,進樣量 500μL,柱溫 30℃。

1.2.6 分析型 HPLC分析 島津 LC-20A分析型HPLC色譜條件：Sunfire C18反相色譜柱 (150mm × 4.6mm i.d.,5μm),流動相為甲醇∶水 (v/v)=85∶15,二極管陣列檢測器 (PDA),流速 1.0mL/min,上樣量10μL,檢測波長 205nm,柱溫 30℃。

1.2.7 DHA海藻糖單酯結(jié)構(gòu)鑒定 核磁共振(NMR)：樣品溶解于氘代甲醇中,用 BRUKER 500MHz核磁共振儀測定產(chǎn)物的13C NMR圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHA海藻糖酯的合成與 HPLC-MS分析

DHA乙酯與海藻糖進行酯交換反應(yīng)的過程見圖 1,由于海藻糖是分子結(jié)構(gòu)對稱的二糖,6-和 6′-位置的羥基較活躍,因此,有可能在 6-OH和 6′-OH上進行酯交換反應(yīng),生成相應(yīng)的DHA海藻糖的單酯和二酯。

圖1 DHA海藻糖酯的合成路線

實驗中得到的合成反應(yīng)液經(jīng)過濾、梯度洗脫和在線柱后質(zhì)譜鑒定,結(jié)果如圖 2和圖 3所示。圖 2顯示,合成反應(yīng)液經(jīng)過液相色譜儀后出現(xiàn)較多的峰,但是經(jīng)在線質(zhì)譜檢測,發(fā)現(xiàn)只是在保留時間為 8.27min和 17.54min的組分為可能的目標產(chǎn)物。

圖2 DHA海藻糖酯反應(yīng)液的色譜分離圖

圖3 DHA海藻糖酯的ESI-MS離子流譜

電噴霧電離是通過常壓電離源,使待分析樣品的分子質(zhì)子化而生成單電荷離子[9-11]。圖 3(a)為保留時間 8.27min的組分的MS圖譜,DHA海藻糖單酯的相對分子質(zhì)量為 652.35,ES-圖譜上出現(xiàn)的 m/z值為 651.7的峰,是[M1-H]的質(zhì)譜信號。其它 m/z值為 697.8、327.3、1304.3的峰分別為[M1+HCOO-]、[C22H31O2]-(DHA酸根)、[2M1-1]的質(zhì)譜信號;而ES+圖譜上出現(xiàn)的 m/z值為 675.7、691.8、1328.2的峰分別為[M1+Na]、[M1+K]、[2M1+Na]的質(zhì)譜信號,因此證明了DHA海藻糖單酯的存在。圖3(b)為保留時間 17.54min組分的MS圖譜,DHA海藻糖二酯的相對分子質(zhì)量為 962.58,ES-圖譜上出現(xiàn)的 m/z值為 962.1、1008.1、327.3的峰分別為 [M2-H]、[M2+HCOO-]、掉下的 DHA酸根碎片的質(zhì)譜信號,而ES+圖譜上出現(xiàn)的 m/z值為 986.0的峰為[M2+Na]的質(zhì)譜信號。因此,在酯交換反應(yīng)過程中,固定化脂肪酶催化DHA乙酯和海藻糖酯交換反應(yīng)生成的產(chǎn)物是DHA海藻糖單酯和二酯的混合物。由于在 C18反相色譜柱上極性大的組分先出峰,極性小的組分后出峰,DHA海藻糖單酯、DHA藻糖二酯的極性依次減弱,因此圖2中DHA海藻糖單酯在DHA藻糖二酯前面出峰。

2.2 DHA海藻糖酯的硅膠柱層析分離及 TLC分析

由以上實驗可知,合成反應(yīng)液中含有DHA海藻糖單酯、DHA藻糖二酯以及其它雜質(zhì),將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析分離純化,并用 T LC進行分析。圖 4中1、2和 3分別是DHA海藻糖單酯、二酯和酶催化合成的反應(yīng)液。DHA乙酯極性最弱,易隨流動相遷移,因而出現(xiàn)在溶劑前沿;產(chǎn)物 DHA海藻糖二酯極性較弱,故 Rf值較大;單酯極性相對較大,故 Rf值較小,糖在該 TLC條件下不顯色,由于單酯和二酯在硅膠板上分離效果較好,且均為一個點,可初步認定它們?yōu)榧兾镔|(zhì)。

圖4 DHA海藻糖酯的TLC圖譜

2.3 半制備型 HPLC純化

為了得到純度更高的DHA海藻糖單酯,將硅膠柱色譜分離純化得到的 DHA海藻糖單酯收集液真空濃縮,除去溶劑后加入色譜甲醇溶解,經(jīng) 0.45μm尼龍膜微濾后,用半制備型高效液相色譜進一步純化。經(jīng)過對流動相組成、洗脫速度和進樣量等諸因素的優(yōu)化,得出最佳色譜條件：流動相甲醇∶水 (v/v) =85∶15,流速 8.0mL/min,檢測波長 205nm,進樣量500μL,柱溫 30℃。按上述半制備色譜條件洗脫,收集各峰,再經(jīng)MS分析(結(jié)果略),最終確定保留時間18.0～21.0min的峰為單酯組分 (見圖 5)。

圖5 樣品的制備色譜分離圖

2.4 DHA海藻糖單酯的鑒定

將半制備液相得到的純品減壓濃縮去除溶劑后,按 1.2.6中方法用分析型 HPLC進行純度檢測,圖6中 t=7.024min處是DHA海藻糖單酯的洗脫峰,以面積歸一化法測得產(chǎn)物純度 ＞97%。

圖6 DHA海藻糖單酯的高效液相色譜圖

采用 NMR儀對純品進行分子結(jié)構(gòu)鑒定：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ(μg/mL)：5.36(12H,m), 5.08(1H,d,J=3.6Hz),5.06(1H,d,J=3.6Hz),4.35 (1H,d,J=11.9Hz),4.20(1H,dd,J=11.9,5.1Hz), 4.02(1H,m),3.80(4H,m),3.65(1H,dd,J=11.7, 5.1Hz),3.49(2H,m),3.34(2H,m),2.80(10H,m), 2.39(4H,s),2.07(2H,m),0.96(3H,t,J=7.0 Hz);13C NMR(500MHz,CD3OD)δ(μg/mL)：95.542(C1), 73.476(C2),72.200(C3),71.699(C4),74.787(C5), 64.824(C6),95.406(C1′),73.512(C2′),72.228 (C3′),71.699(C4′),74.954(C5′),62.943(C6′), 174.993(C=O),133.09,130.55,129.745,129.745, 129.486,129.486,129.427,129.427,129.394,129.394, 129.217,128.474(all are-CH=CH-carbon),35.27, 26.859,26.859,26.802,26.728,26.728,24.04,21.776 (all are-CH2-carbon),14.941(CH3)。ESI-MS m/z 651.7[M-H]-,675.7[M+Na]+,691.8[M+K]+。結(jié)合MS分析結(jié)果,可確定該產(chǎn)品為 6-O-DHA海藻糖單酯。

3 結(jié)論

利用固定化脂肪酶在非水體系中對 DHA乙酯和海藻糖進行酯交換反應(yīng),經(jīng) HPLC/MS分析,合成的反應(yīng)液中存在DHA海藻糖的單酯和二酯。將反應(yīng)液進行減壓濃縮,以薄層層析(T LC)作為輔助檢測手段,用硅膠柱層析分離各個組分,分別得到 DHA海藻糖單酯和二酯粗品,利用半制備液相對其中的單酯樣品進一步純化,得到純度大于 97%的純品,經(jīng)NMR鑒定,確認該物質(zhì)為 6-O-DHA海藻糖單酯。

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Separation,purification and identification of docosahexaenoyl trehalose

SUN Yue-e,XI A W en-shui,CHEN Jie＊
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Docosahexaenoyl treha lose(DHA)was synthes ized from docosahexaenoic ac id e thyl es te r and treha lose in te rt-butanol us ing imm ob ilized l ip ase as b ioca ta lys t.The p urifica tion and ana lys is m e thods we re inves tiga ted.The m ob ile p hase for the thin laye r chrom a tog rap hy(TLC)was e thyl ace ta te/m e thanol/wa te r(8.5/1/0.5,v/v/v)and iod ine was used for deve lopm ent.The s ilica ge l colum n chrom a tog rap hy cond itions we re as follows：g rad ient m ob ile p hases of hexane-isop rop anol-m e thanol5∶4∶1(v/v/v)and4∶4∶2(v/v/v)we re used in turn.The flow ra te was1.3mL/m in and the e luent of1tube/7m in was collec ted.The e luent of m ono-docosahexaenoyl treha lose was p urified w ith sem i-p rep a ra tive high p e rform ance liquid chrom a tog rap hy HPLC furthe r and then was identified by nuc lea rm agne tic resonance(NMR).

docosahexaenoic ac id(DHA);docosahexaenoyl treha lose; imm ob ilized lip ase;p urifica tion;NMR

TS201.2+3

A

1002-0306(2010)03-0200-04

非水相酶法催化酯交換反應(yīng)是一個嶄新的研究領(lǐng)域,與傳統(tǒng)的化學合成法相比,酶催化合成具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點。大量研究證實,DHA為人體必需的多不飽和脂肪酸,具有抑制血小板凝聚、抗血栓、防治心腦血管疾病[1]、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2]、促進智力發(fā)育等功能[3],此外,還具有抗腫瘤作用[4-5]。海藻糖是天然雙糖中較穩(wěn)定的二糖,無還原性,在食品中加熱不發(fā)生美拉德反應(yīng)。海藻糖作為一種天然二糖,它不僅具有其它低聚糖的特性,而且還具有獨特的生物活性——對生物體和生物分子具有獨特的非特異性保護作用[6]。研究表明,許多生物在脅迫環(huán)境 (如饑餓、高溫、冷凍、干燥、高滲、輻射、有毒物質(zhì)等)下表現(xiàn)出的抗逆耐受力與體內(nèi)的海藻糖含量有直接的關(guān)系[7-8]。因此,通過酯交換反應(yīng)把海藻糖和DHA結(jié)合成酯能同時發(fā)揮兩種活性成分的生物學功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯的分離純化方法和鑒定方法,即通過薄層層析、硅膠柱層析和半制備反相HPLC分離純化目標產(chǎn)物,采用液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-ESI-MS)及核磁共振技術(shù)對DHA海藻糖單酯進行鑒定。

2009-05-05 ＊通訊聯(lián)系人

孫月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向：食品脂質(zhì)氧化。

國家自然科學基金課題(20401007)以及江蘇省創(chuàng)新人才基金課題(BK2006503)支持。