納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌醇方法的建立

周 彬，高 雷，金 堅(jiān)，陳 蘊(yùn)，黃 飚，*，趙衛(wèi)國(guó)

(1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214063; 2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214063;3.博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司，上海200000)

納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌醇方法的建立

周 彬1，高 雷2，金 堅(jiān)2，陳 蘊(yùn)2，黃 飚1，*，趙衛(wèi)國(guó)3

(1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214063; 2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214063;3.博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司，上海200000)

目的:利用抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)多克隆抗體，采用納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法測(cè)定技術(shù)(AlphaLISA)建立間接競(jìng)爭(zhēng)DON定量檢測(cè)方法。方法:DON－BSA包被發(fā)光微粒，生物素化羊抗兔抗體與包被有鏈霉素的感光微粒共同構(gòu)成檢測(cè)試劑，優(yōu)化檢測(cè)條件并評(píng)價(jià)檢測(cè)性能。結(jié)果:該方法的靈敏度為0.007ng/mL，檢測(cè)范圍為0.007～100ng/mL，批內(nèi)批間變異系數(shù)均＜5%。不同樣品添加回收實(shí)驗(yàn):玉米、小麥、啤酒回收率分別為84%～110%、67%～100%、74%～100%。結(jié)論:DON－AlphaLISA是目前DON檢測(cè)中最靈敏的方法之一，該分析方法穩(wěn)定性好，可測(cè)范圍寬，具有很好的應(yīng)用前景。

脫氧雪腐鐮刀烯醇，生物毒素，納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DON人工抗原、抗DON多克隆抗體和DON標(biāo)準(zhǔn)品及DON酶免試劑盒 江蘇省微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;親和層析純化的生物素化羊抗兔IgG 洛陽(yáng)華美生物工程公司;光激化學(xué)感光液、發(fā)光微粒、白色不透明微孔板、AlphaLISA檢測(cè)儀 上海博陽(yáng)生物科技有限公司;檢測(cè)樣品購(gòu)于本地超市;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)品的配制 用樣品稀釋液(10mmol/L，pH7.4的PBS)稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA方法的建立

1.2.2.1 DON人工抗原包被發(fā)光微粒的制備 在離心管中加入1mg感光微粒，12.5μL 1%Tween－20，0.05mg DON－BSA抗原，10μL硼氫化氰鈉，用0.1mol pH6.0的2－(N－嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充至200μL，37℃避光反應(yīng)48h。然后加入10μL 0.3mol pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37℃避光孵育1h后離心，分離得到已連接DON－BSA的感光微粒，稀釋后備用。

1.2.2.2 樣品處理 稱取谷物樣品或其制品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min后，用微孔濾膜(直徑為0.45μm)過(guò)濾，取1mL濾液用1mL蒸餾水稀釋備用。啤酒樣品用蒸餾水比例稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。谷物及其制品中DON含量(ng/g)=提取液中DON含量×10。啤酒樣品中DON含量為測(cè)得值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.2.2.3 檢測(cè)步驟 取白色微孔板若干，加入20μL/孔包被有DON－BSA的發(fā)光微粒，加入20μL/孔DON標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，然后加入20μL/孔的DON多克隆抗體，最后加入生物素化的羊抗兔抗體。充分混勻上述各種試劑，37℃溫育，加入包被有鏈霉親合素的感光微粒(100μg/mL)175μL，37℃溫育。在AlphaLISA檢測(cè)儀中檢測(cè)每孔發(fā)光光子量，根據(jù)光信號(hào)的強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品DON的濃度，見(jiàn)圖1。

圖1 均相間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA檢測(cè)原理

1.2.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 建立間接競(jìng)爭(zhēng) DONAlphaLISA方法，對(duì)DON人工抗原－發(fā)光微粒，DON多抗稀釋度，生物素化－羊抗兔抗體稀釋度予以選擇，以達(dá)到最適的測(cè)定條件和節(jié)省測(cè)定費(fèi)用。

a.DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇 取白色微孔板，用反應(yīng)緩沖液將DON抗原－發(fā)光微粒作一系列稀釋:1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，每種濃度1條，最后2孔只加反應(yīng)緩沖液以作空白對(duì)照。DON多克隆分別以1∶100，1∶500，1∶1000，1∶5000，1∶10000稀釋，每個(gè)濃度2孔/條。按1.2.2.3步驟測(cè)定各稀釋度的熒光計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

b.生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定 按照已經(jīng)確定的DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度，取白色微孔板，第一條加入20μL DON抗原－發(fā)光微粒，20μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(零濃度點(diǎn))和20μL抗DON多克隆抗體，第二條加入20μL DON抗原－發(fā)光微粒，20μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和20μL抗體稀釋液(非特異結(jié)合，Nonspecific binding，NSB)。將生物素化羊抗兔 IgG用稀釋液作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800等比例稀釋后分別加入上述板條中，20μL/孔，每個(gè)稀釋度兩孔。按1.2.2.3步驟測(cè)定各稀釋度的熒光計(jì)數(shù)，以熒光計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)，生物素化羊抗兔IgG稀釋度為橫坐標(biāo)，繪制曲線。選擇零點(diǎn)熒光計(jì)數(shù)高，NSB低的生物素化羊抗兔IgG稀釋度作為工作濃度。

c.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)考察 最適競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度、時(shí)間的確定:按已確定的試劑工作濃度分別加入到白色微孔板中，25℃或37℃條件下，分別溫育10、15、30、45min，給予感光微粒充足的反應(yīng)時(shí)間。其他步驟同1.2.2.3，測(cè)定不同溫度以及競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線變化趨勢(shì)。連有鏈霉親合素的感光微粒反應(yīng)溫度、時(shí)間的確定:按1.2.2.3操作，感光微粒反應(yīng)以不同的溫度:25、37℃溫育，不同的時(shí)間:10、15、30、45min，測(cè)定零濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)。

d.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由AlphaLISA分析儀直接得到的是各劑量點(diǎn)對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)值(CPS)，通過(guò)origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.3 方法學(xué)考核

1.3.1 回收率 稱取玉米、小麥樣品或加有DON標(biāo)準(zhǔn)品的玉米、小麥樣品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min，微孔濾膜(直徑=0.45μm)過(guò)濾，取1mL濾液用PBS稀釋備用。通過(guò)計(jì)算實(shí)測(cè)值與理論值比值得出回收率。添加不同量的DON標(biāo)準(zhǔn)品的啤酒樣品，經(jīng)比例稀釋后直接檢測(cè)。

1.3.2 方法學(xué)的比較 取啤酒樣品若干份，采用DON－AlphaLISA和DON－ELISA進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。分別用DON－AlphaLISA、DON－ELISA兩種不同的免疫檢測(cè)法對(duì)16份啤酒和22份玉米樣品進(jìn)行分析，比較不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇

標(biāo)記DON－BSA以及標(biāo)記成功后復(fù)合物反應(yīng)濃度對(duì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度有著至關(guān)重要的影響作用。因此選擇合適的稀釋比例是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。在實(shí)驗(yàn)中深入探討了連有發(fā)光微粒的DONBSA以及抗DON PcAb最佳工作濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，當(dāng)連有發(fā)光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶10時(shí)，雖然可以得到較高的計(jì)數(shù)(接近或大于10000)，但是由于高濃度的發(fā)光微粒導(dǎo)致本底比較高(本底為256);當(dāng)連有發(fā)光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶1000時(shí)，可以有效的降低本底(本底僅為38)，但數(shù)零點(diǎn)計(jì)數(shù)下降明顯(最高計(jì)數(shù)為3493)。因此，選擇經(jīng)過(guò)適當(dāng)比例稀釋的DON抗原－發(fā)光微粒意義非同尋常，必須滿足保證有效的計(jì)數(shù)，同時(shí)又可以節(jié)約成本和降低本底。根據(jù)上述要求，稀釋比在1∶100左右較為適合。

選取適當(dāng)?shù)亩嗫節(jié)舛瓤梢蕴岣邫z測(cè)靈敏度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:多抗稀釋比在1∶1000～1∶5000范圍內(nèi)比較適合，既滿足了檢測(cè)要求也節(jié)約了試劑用量。

表1 DON－BSA－發(fā)光微粒和抗DON PcAb工作濃度的選擇(熒光計(jì)數(shù)(CPS))

2.2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定

選擇合適的生物素化羊抗兔IgG稀釋度，既能保證有足夠的量結(jié)合到第一抗體上，又要避免引起非特異計(jì)數(shù)(NSB)的增加。在間接競(jìng)爭(zhēng) DONAlphaLISA，進(jìn)行第二步反應(yīng)時(shí)，抗體稀釋液將生物素化羊抗兔IgG稀釋成不同的濃度，結(jié)果如圖2。

圖2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的選擇

由圖2可知，當(dāng)生物素化羊抗兔IgG的稀釋比不斷加大時(shí)，零濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)以及NSB均在1∶100稀釋后開(kāi)始下降明顯，而在1∶200稀釋后，下降趨于平緩。生物素化羊抗兔IgG 1∶100稀釋時(shí)，其零濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)為1∶50的61.2%，NSB為1∶50的21.78%。所以，選擇1∶100的生物素化羊抗兔IgG作為最佳稀釋濃度。

2.3 不同溫度下的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的確定

反應(yīng)溫度分別設(shè)在25、37℃，進(jìn)行時(shí)間動(dòng)力學(xué)的考核。25℃，給予充足的示蹤反應(yīng)時(shí)間(生物素與親和素結(jié)合反應(yīng))，測(cè)定不同競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間下標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 25℃，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)DON－AlphaLISA的影響

由圖3可知隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)逐漸增大，但增幅各不相同，ED50所對(duì)應(yīng)的濃度點(diǎn)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減小，曲線靈敏度趨高。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間30min與45min下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，已無(wú)明顯差異。因此，選擇30min為最適競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間。

按照同樣的方法，將反應(yīng)溫度設(shè)為37℃，繪制不同競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間下標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。按照上述分析原理，此時(shí)15min的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間已經(jīng)得到靈敏度較高的標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，37℃反應(yīng)溫度下，15min為最適競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間。從節(jié)約時(shí)間成本的角度考慮，選擇37℃，15min為DON－AlphaLISA競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)條件。

圖4 37℃，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)DON－AlphaLISA的影響

2.4 連有鏈霉親合素的感光微粒反應(yīng)溫度、時(shí)間的確定

生物素與親和素可以在較短的時(shí)間內(nèi)完成結(jié)合反應(yīng)。在25℃條件下，不同示蹤時(shí)間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明15～30min的反應(yīng)時(shí)間基本能夠完成生物素與親和素結(jié)合反應(yīng)。

圖5 25℃，示蹤時(shí)間對(duì)DON－AlphaLISA的影響

在37℃條件下，不同示蹤時(shí)間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果見(jiàn)圖6。反應(yīng)時(shí)間為10min時(shí)生物素與親和素的反應(yīng)完成一半或許更多。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至15min已經(jīng)基本完成反應(yīng)。進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)提高檢測(cè)的靈敏度并無(wú)顯著影響。因此，選擇37℃，15min作為示蹤反應(yīng)時(shí)間即可。

2.5 DON－AlphaLISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

綜合各項(xiàng)優(yōu)化的結(jié)果，間接競(jìng)爭(zhēng) DONAlphaLISA的最適檢測(cè)條件為:DON人工抗原－發(fā)光微粒稀釋度1∶100;抗DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時(shí)間分別是37℃ 15min和37℃ 15min。間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA的結(jié)果經(jīng)orgin軟件處理所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖7。

圖6 37℃，示蹤時(shí)間對(duì)DON－AlphaLISA的影響

圖7 均相間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

以10組標(biāo)準(zhǔn)曲線零濃度點(diǎn)計(jì)數(shù)的平均值(ˉX)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以ˉX的計(jì)數(shù)減2倍SD所得的計(jì)數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)濃度及方法的檢測(cè)靈敏度。間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測(cè)范圍為0.007～100ng/mL，IC50為4.84ng/mL。

2.6 添加回收率實(shí)驗(yàn)

已知濃度的DON添加到各樣品中，采用均相間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA方法檢測(cè)，各個(gè)濃度的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看到，平行孔間的CV相對(duì)較小，這可能是由于均相檢測(cè)的原因，減少人為操作誤差導(dǎo)致的批內(nèi)變異。這一結(jié)果充分說(shuō)明了檢測(cè)穩(wěn)定性較好。整個(gè)樣品添加回收率偏低，這可能是樣品處理過(guò)程中損失造成的。除了個(gè)別樣品，大部分也還在可接受范圍內(nèi)(＜±20%)。

表2 添加回收率測(cè)定結(jié)果

2.7 方法學(xué)比較

2.7.1 DON－AlphaLISA和DON－ELISA檢測(cè)啤酒和玉米樣品的比較 用本實(shí)驗(yàn)室建立的DONAlphaLISA和DON－ELISA同時(shí)檢測(cè)16份啤酒樣品，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖8所示。其 Y=1.05910X－0.5185，相關(guān)系數(shù)為0.9525，表明兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性很好。由結(jié)果觀察測(cè)得值在較低濃度范圍內(nèi)(＜10ng/mL)，DONAlphaLISA測(cè)得值略微高于DON－ELISA，而在高濃度范圍內(nèi)又呈現(xiàn)出相反的關(guān)系。導(dǎo)致這樣的結(jié)果，可能是啤酒中存在某些干擾基質(zhì)。

圖8 不同免疫檢測(cè)法檢測(cè)啤酒樣品的結(jié)果比較

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的DON－AlphaLISA試劑盒和DON－ELISA試劑盒檢測(cè)22份玉米樣品，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照比較。結(jié)果如圖9所示。其Y=0.0508+1.1591X，R=0.9167，其中兩份樣品由于DON含量低于DON－ELISA檢測(cè)限，而DONAlphaLISA的檢測(cè)值分別為0.075ng/mL和0.037ng/mL。表明兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性很好且DON－AlphaLISA檢測(cè)方法更靈敏。

圖9 不同免疫檢測(cè)法檢測(cè)玉米樣品的結(jié)果比較

3 結(jié)論

納米均相時(shí)間分辨熒光(AlphaLISA)是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。AlphaLISA技術(shù)的核心原理是高能態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為高能態(tài)離子氧，如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受離子氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520～620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒(méi)有發(fā)光微粒，高能態(tài)離子氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生［6－7］。

DON－AlphaLISA的測(cè)定基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有發(fā)光微粒的DON－BSA加入微孔板，然后順序加入DON標(biāo)準(zhǔn)或樣品、抗DON PcAb、生物素化羊抗兔抗體避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。包被有發(fā)光微粒的DON－BSA與DON競(jìng)爭(zhēng)連接到DON抗體，然后與生物素化羊抗兔IgG以及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，在特定條件下發(fā)光微粒將信號(hào)通過(guò)連接在一起的復(fù)合體傳遞給感光微粒產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)光信號(hào)，光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中的DON濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測(cè)樣品中DON的含量。

我們建立了均相DON－AlphaLISA免疫檢測(cè)法，均相間接競(jìng)爭(zhēng)DON－AlphaLISA的最適檢測(cè)條件為: DON人工抗原－發(fā)光微粒稀釋度1∶100;抗 DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時(shí)間均為 37℃15min。DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測(cè)范圍為0.007～100ng/mL。

DON－AlphaLISA兩步共30min的反應(yīng)模式大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)由于免清洗減少了人為誤差，使得檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性非常好，批內(nèi)、批間變異率＜5%。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以自動(dòng)化，方便進(jìn)行大批量檢測(cè)。檢測(cè)范圍寬達(dá)到0.007～100ng/mL靈敏度和高達(dá)到0.007ng/mL。通常高的靈敏度檢測(cè)法常常易受本底干擾。但是在本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有顯現(xiàn)出明顯的基質(zhì)干擾現(xiàn)象(本底＜20計(jì)數(shù))。DON－AlphaLISA另一大優(yōu)勢(shì)是節(jié)約試劑劑量，檢測(cè)樣本量較少僅為20μL/孔。添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明回收率均值在90%左右，同時(shí)CV值較小說(shuō)明檢測(cè)的穩(wěn)定性較好。

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［7］Edwin F，Ullman，Hrair Kirakossian，et al.Luminescent oxygen channeling immunoassay:Measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence［J］.Biochemistry，1994，91(6): 5426－5430.

Quantitative determination of deoxynivalenol using light initiated chemiluminescence assay

ZHOU Bin1，GAO Lei2，JIN Jian2，CHEN Yun2，HUANG Biao1，*，ZHAO Wei－guo3
(1.Key Laboratory of Nuclear Medicine，Ministry of Health PRC，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine of Jiangsu province，Wuxi 214063，China;2.School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214063，China; 3.Shanghai Boyang Biotechnology Company Ltd.，Shanghai 200000，China)

Objective:An indirect competitive light initiated homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA)was established by using anti－DON polyclonal antibody and coating antigen DON－BSA for detection of deoxyhivalenol in cereal.Method:DON－BSA was coated on chenilum inescent particles，the AlphaLISA kit also contained sensitizer particles coated with strep tavidin.The optinal test conditions and analytical performance of the method were studied.Results:Working concentration range from 0.007 to 100ng/mL and the sensitivity for detection was 0.007ng/mL.The intra－and inter－assay CV of the assay were both below 5%.The recoveries of determination for deoxynivalenol spiked in corn，wheat，beer were 84%～110%、67%～100%、74%～100%.Conclusions:This AlphaLISA method is a good method with high sensitivity for quantitative analyzing DON in cereal.

deoxynivalenol;biotoxin;homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay(AlphaLISA)

Q939.91

A

1002－0306(2010)08－0338－05

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯族毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生。目前，世界范圍內(nèi)DON對(duì)谷物的污染居各種生物毒素之首，呈較嚴(yán)重的狀況，而長(zhǎng)期暴露于高濃度的DON毒素可導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良，表現(xiàn)不同水平的中毒癥狀，甚至死亡［1］。因此監(jiān)控DON的含量顯得意義重大。我國(guó)目前小麥、玉米中DON的限量為1000μg/kg［2］，而部分國(guó)家(如奧地利和歐盟等)的限量標(biāo)準(zhǔn)低于我國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)DON的方法有理化檢測(cè)法和免疫化學(xué)法。前者主要包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)［3］。后者研究較多的是酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)［4－5］。ELISA檢測(cè)法存在標(biāo)記物酶易失活、底物見(jiàn)光易分解、環(huán)境干擾因素復(fù)雜等缺點(diǎn)，且已不能滿足越來(lái)越低的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究采用快速高靈敏的納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)檢測(cè)谷物及其制品中的DON含量。

2009－08－20 *通訊聯(lián)系人

周彬(1981－)，男，研究實(shí)習(xí)員，研究方向:食品安全檢測(cè)。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)(2008AA10Z415);江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向課題(SKLFMB－200801)。