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    硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查驗(yàn)證

    2010-10-31 08:52:12丘展鋒黃國玉
    中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2010年16期
    關(guān)鍵詞:試液菌液氯化鈉

    丘展鋒 黃國玉

    建立硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法,并對該法的有效性進(jìn)行評價,通過試驗(yàn)確定了硝酸咪康唑乳膏的微生物限度檢查方法。

    1 材料與方法

    1.1 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;改良馬丁液體培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;司盤80;單硬脂酸甘油酯;聚山梨酯80;0.9%無菌氯化鈉溶液;pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液;膽鹽乳糖培養(yǎng)基;甘露醇高鹽瓊脂平板;十六烷三甲基溴化銨平板。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高壓蒸汽滅菌鍋、天平、凈化間、凈化工作臺、恒溫生化培養(yǎng)箱過濾器。

    1.3 陽性對照菌:大腸埃希菌[CMcc(B)44102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];銅綠假單孢菌[ECMCC(B)10104];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉菌[CMCC(F)98003](菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供)。

    1.4 硝酸咪康唑乳膏,廣東慶發(fā)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

    2 方法

    2.1 供試品的制備 取供試品5 g,加至含溶化的(溫度不超過45℃)5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80無菌混合物的三角燒杯中,用無菌玻璃棒攪拌成團(tuán)后,慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液100 ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20的供試液。

    2.2 陽性對照菌液的制備 文獻(xiàn)[1]取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃ 下培養(yǎng)18 h,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50~100 cfu的陽性對照菌液備用;另取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于改良馬丁液體培養(yǎng)基中,25℃ 下培養(yǎng)24 h,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50~100 cfu的陽性對照菌備用;取黑曲霉斜面培養(yǎng)物,至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7 d,加3~5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸出菌液,至無菌試管內(nèi),用0.9%氯化鈉溶液稀釋至每1 ml含菌數(shù)約為50~100cfu的陽性對照菌備用。

    2.3 檢查方法驗(yàn)證 依《中國藥典》[1]2005年版二部附錄ⅩⅢC“微生物限度檢查方法”中薄膜過濾法過濾,用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗3次,每次100 ml,最后一次沖洗,加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌取過濾膜貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,30℃ ~35℃培養(yǎng)48 h;加入白色念珠菌、黑曲霉取過濾膜貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基2O℃~25℃培養(yǎng)72 h。①陽性對照菌液組:取“2.2”項(xiàng)下的對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml,分別注入平皿,傾注相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)。結(jié)果(見表1)。②稀釋劑對照組:取含溶化的(溫度不超過45℃)5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80無菌混合物的三角燒杯中,用無菌玻璃棒攪拌成團(tuán)后,慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液100 ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1:20的供試液,取該供試液各1 ml分別加入含有100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗3次,每次100 ml,在最后一次沖洗液中分別加入“2.2”項(xiàng)下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml濾干,取過濾膜貼于相應(yīng)培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)。結(jié)果(見表1);③供試品對照組:取“2.1.”制備的供試液各1 ml,分別加入含有100 ml0.9%氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗3次,每次100 ml濾干,取過濾膜貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)。結(jié)果(見表1);④ 供試品試驗(yàn)組:取“2.1”制備的供試液各1 ml,分別加入含有100 ml0.9%無菌氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗3次,每次100 ml,在最后一次沖洗液中分別加入“2.2”項(xiàng)下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml濾干,取過濾膜貼于相應(yīng)培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)。結(jié)果(見表1)。以上各組每次試驗(yàn)用2個平皿,試驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 各菌種試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證 ①金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證:控制菌測定所用培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間:加金黃色葡萄球菌至100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng),置35℃培養(yǎng)24 h后,劃線于甘露醇高鹽瓊脂平板,置35℃培養(yǎng)24 h。

    陽性對照組:取“2.2”項(xiàng)下對照菌液金黃色葡萄球菌1 ml,加入含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果(見表2)。陽性試驗(yàn)組:取“2.1”制備的供試液20 ml,加入含有500 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗5次,每次100 ml,在最后一次沖洗液中加入“2.2”項(xiàng)下對照菌液金黃色葡萄球菌濾干,取膜接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果(見表2)。

    供試品對照組取“2.1.”制備的供試液20 ml,加入含有500 ml 0.9%無菌氯化鈉溶中混合過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗5次,每次100 ml濾干后,取膜接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察。結(jié)果(見表2);②銅綠假單孢菌檢查方法的驗(yàn)證;控制菌測定所用培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間:加銅綠假單胞菌至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),置35℃培養(yǎng)24 h后,劃線于十六烷三甲基溴化銨平板,置35℃培養(yǎng)24 h。

    陽性對照組:取“2.2”項(xiàng)下對照菌液銅綠假單胞菌1 ml,加入含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),結(jié)果(見表2)。陽性試驗(yàn)組:取“2.1.”制備的供試液20 ml,加入含有500 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗5次,每次100 ml,在最后一次沖洗液中加入“2.2”項(xiàng)下對照菌液銅綠假單胞菌濾干,取膜接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果(見表2)。供試品對照組:取“2.1.”制備的供試液20 ml,加入含有500 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中搖勻過濾,然后用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗5次,每次100 ml,濾干后,取膜接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察。結(jié)果(見表2)。

    表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

    3 討論

    《中國藥典》2005年版規(guī)定微生物限度檢查法結(jié)果判定在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中,稀釋液對照組及試驗(yàn)組細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率應(yīng)不低于70%,低于70%則表明該樣品有抑菌作用??刂凭鷻z查方法驗(yàn)證時,陽性對照菌應(yīng)檢出,陰性對照菌不得檢出。如驗(yàn)證結(jié)果達(dá)不到規(guī)定,應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性,并對方法重新進(jìn)行驗(yàn)證。

    從以上結(jié)果可以看出,該試驗(yàn)方法細(xì)菌、霉菌和酵母菌回收率達(dá)到《中國藥典》2005年版的規(guī)定要求,測定結(jié)果準(zhǔn)確,穩(wěn)定,說明所建微生物限度檢查法可用于硝酸咪康唑乳膏的質(zhì)量控制。

    [1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典.化工工業(yè)出版社,2005.

    [2] 鄭鈞鏞,王光寶.藥品微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù).人民衛(wèi)生出版社,1989.

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