雙功能化膠體金納米探針的制備及其特異性考察

楊 冰,黃樂群

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210093)

雙功能化膠體金納米探針的制備及其特異性考察

楊 冰,黃樂群

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210093)

目的：制備一種新型的雙功能化膠體金納米探針,并考察其特異性。方法：選擇二硫化物分子和甲型流感病毒 (H1N1亞型)HA基因中特異性的 23 mer寡核苷酸片段組裝到膠體金顆粒表面,制成雙功能化膠體金納米探針 (識別探針,顏色呈酒紅色);利用磁性微球作為固相支持物,偶聯(lián)另一段特異性 H1N1寡核苷酸片段制成捕捉探針;兩者與靶 DNA(完全匹配 DNA)結(jié)合,形成無色的捕捉探針-靶 DNA-識別探針 (“三明治”夾心式復(fù)合物),并采用基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜 (MALD I TOFMS)測定。同時,在選擇向體系中分別加入超純水 (作為空白對照)、完全匹配 DNA、不完全匹配DNA及 2條僅有 1個堿基錯配的DNA片段作為靶目標(biāo)進行實驗,觀察體系顏色變化及質(zhì)譜測定,考察探針的特異性。結(jié)果：捕捉探針和識別探針只能與完全匹配DNA結(jié)合,形成夾心式復(fù)合物,反應(yīng)體系顏色由酒紅色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色,充分洗滌后加熱去雜交,則由無色復(fù)呈酒紅色,質(zhì)譜檢測出現(xiàn)信號 (m/z 693);而其他靶目標(biāo) (不完全匹配 DNA及 2條僅有 1個堿基錯配的DNA片段)和空白對照實驗,不能與 2種探針形成夾心式復(fù)合物,反應(yīng)體系均沒有顏色變化 (仍呈現(xiàn)酒紅色),充分洗滌后體系呈無色,加熱去雜交體系仍呈無色,質(zhì)譜檢測未見信號 (m/z 693)。這說明膠體金納米探針的特異性很高,可區(qū)分僅有 1個堿基錯配的靶目標(biāo)。結(jié)論：本研究建立了一種新型的自組裝雙功能化膠體金納米探針,其制備過程簡單、特異性很高。此類型膠體金納米探針在核酸分析,尤其是疾病早期診斷,寡核苷酸多態(tài)性分型等方面將有廣泛的應(yīng)用前景。

核酸探針;膠體金;磁力學(xué);微球體;光譜法,質(zhì)量,基質(zhì)輔助激光解吸電離;納米技術(shù)

[J ZhejiangUniv(Medical Sci),2010,39(3)：296-304.]

隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和人類基因組計劃的完成,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重點已經(jīng)深入到以基因和蛋白質(zhì)為主要研究目標(biāo)的分子水平。目前,現(xiàn)有的各種生物分析方法中,常常需要使用各種標(biāo)記物進行標(biāo)記,這些標(biāo)記物有：放射性元素、熒光素及酶[1-3]等,采用這些標(biāo)記物標(biāo)記的探針進行檢測,除具有操作復(fù)雜、費時等缺陷外,還各自都存在著其它一些不足之處。例如：放射性元素標(biāo)記探針雖靈敏度較高,但卻存在著放射性危害等安全隱患;熒光素標(biāo)記探針價格昂貴,并且存在激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬、拖尾造成譜峰重疊以及易于光漂白和光解等缺點;酶作為探針標(biāo)記物仍然無法克服其自身容易失活,不便長期保存等缺陷。

基于納米材料的基因檢測技術(shù)是近十年迅速發(fā)展起來的新興技術(shù),越來越受到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域的重視,逐漸成為生物分析化學(xué)的有力工具之一[4-5]。膠體金是研究較早的一種納米材料,具有很好的生物相容性。它具有卓越的穩(wěn)定性、高靈敏度和大批量可重復(fù)性,因其顆粒小、表面積大以及可標(biāo)記多種物質(zhì)等特點,逐漸成為一種理想的標(biāo)記物。曾有報道,把生物分子標(biāo)記于膠體金表面可以大大提高生物分子之間的結(jié)合能力[6],并且標(biāo)記了膠體金的核酸具有更高的雜交特異性;同時,單鏈DNA的修飾也更有利于膠體金的穩(wěn)定[7]。近年來,美國西北大學(xué)的Mirkin課題組在膠體金納米探針的制備與應(yīng)用方面做了大量工作。將DNA偶聯(lián)于膠體金顆粒表面構(gòu)成納米探針,通過與靶 DNA的雜交,再聯(lián)用其他分析技術(shù),例如掃描法、比色法、光譜法及銀染[8-11]等檢測方法建立新的基因檢測手段已成為一種趨勢。在基因序列的識別和點突變檢測、免疫檢測、基因表達和寡核苷酸多態(tài)性[8,12-14]等方面也進行了許多具有開創(chuàng)性的工作。目前,膠體金制成的納米探針用于檢驗 DNA的方法已逐漸引起人們廣泛關(guān)注,在分子診斷學(xué)領(lǐng)域顯示出光明的發(fā)展前景。

本研究采用檸檬酸三鈉還原氯化金溶液生產(chǎn) 13-nm膠體金顆粒,用于膠體金納米探針制備。選擇三甘醇二硫化物分子作為標(biāo)記物,選擇 23 mer甲型流感 (H1N1)HA基因的特異性寡核苷酸片段作為識別序列,同時將兩者組裝到膠體金顆粒表面制成膠體金納米探針,建立一種新的膠體金標(biāo)記方法,為分子生物學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)診斷提供一種新的基因檢測手段。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (Buchi R-200,德國),水浴箱 (Buchi B-490,德國 ),SHB-AA循環(huán)水式多用真空泵 (河南省太康科教器材廠),85-1磁力攪拌器 (上海志威電器有限公司),WYK-85B型溫度液位多用途控制儀 (揚州師范學(xué)院教學(xué)儀器廠),DH-Ⅱ型 DNA混合器 (浙江寧波新芝生物科技股份有限公司),質(zhì)譜(BrukerUltraflexⅢT OF/T OF mass spectrometer,德國)。

三甘醇 (Alfa Aesar),11-溴-1十一烯 (Alfa Aesar),偶氮二異丁氰 (AR,南京化學(xué)試劑有限公司),硫代乙酸 (CP,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),甲醇鈉 (CP,南京化學(xué)試劑有限公司),碘 (AR,上海試四赫維化工有限公司),硫代硫酸鈉 (AR,南京化學(xué)試劑有限公司),氫氧化鈉(AR,南京化學(xué)試劑有限公司),濃鹽酸 (AR,南京化學(xué)試劑有限公司),柱層析硅膠 (試劑級,300-400目,青島海洋化工廠),硅膠層析板 (G,青島海洋化工廠),正己烷 (AR,南京化學(xué)試劑有限公司),石油醚 (AR,北京長?；S),丙酮 (AR,南京化學(xué)試劑有限公司),甲醇 (AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),二氯甲烷 (AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),乙酸乙酯 (AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),氯金酸 (99.9%)(上海久岳化學(xué)有限公司),巰基修飾 DNA合成與純化 (Takara,大連),磁性微球 (Invitrogen,上海),二甲亞砜 (DMSO)(Sigma,美國),琥珀酰亞胺 (S MPB)(Pierce,美國 ),超純水 (經(jīng)SartoriusArium 611體系純化)。

1.2 二硫化物的化學(xué)合成[15-16]

1.2.1 1-十一烯-11-三乙烯基乙二醇 (Undec-l-en-11-yltri(ethylene glycol))(3a)的制備 將50%氫氧化鈉 (NaOH)溶液 2.0 ml和三甘醇0.2 mol,在氮氣 (N2)保護下,硅油浴 100℃反應(yīng) 30 min,然后加入 11-溴-1-十一烯 20.0 mmol,反應(yīng) 24 h。溶液由黑褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t棕色澄清溶液,冷卻至室溫,正己烷萃取,合并萃取液,減壓濃縮,得黃色油狀液體。硅膠柱色譜分離純化,洗脫液為石油醚 /丙酮 /甲醇 (V/V/V)=64/16/1,得到油狀液體 (3a)5.6 g,收率為97%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.19～1.27(br s,12H),1.51～1.55(qui,2H),1.94～1.99(q,2H),2.63(br s,1H),3.37～3.42(t,2H),3.46～3.65(m,12H),4.84～4.95(m,2H),5.70～5.83(m,1H);ESI(m/z)：324.9[M+Na]+。

1.2.2 1-硫代乙酰基十一烷-11-三乙烯基乙二醇([1-[(Methylcarbonyl)thio]undec-11-yl]tri(ethylene glycol))(3b)的制備 將 (3a)5.0 g溶于甲醇配制成 200～400 mmol/L的溶液,加入 2～4倍的硫代乙酸和偶氮二異丁氰,混合均勻,倒入紫外反應(yīng)管,連接紫外反應(yīng)器,通氮氣30 min后,開冷凝水,450 nm紫外燈照射 4～6 h。合并反應(yīng)液,減壓濃縮,得淡黃色油狀液體。硅膠柱色譜分離純化,石油醚 /丙酮 /甲醇 (V/V/V)=30∶10∶1洗脫 ,得到油狀液體 (3b)3.9 g,收率為 58%。1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ1.21～1.26(br s,14H),1.52～1.58(m,4H),2.23(s,3H),2.82～2.87(t,2H),3.41～3.45(t,2H),3.48～3.67(m,12H);ESI(m/z)：401.6[M+Na]+。

1.2.3 1-巰基十一烷-11-三乙烯基乙二醇 ((1-Mercaptoundec-11-yl)tri(ethylene glycol))(3c)的制備 將 (3b)3.5 g溶于 100 ml甲醇,氮氣保護下溫度降至 0℃,投入甲醇鈉 25 mmol,反應(yīng) 30 min,用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH值至 4.0,減壓濃縮,得淡黃色油狀液體。硅膠柱色譜分離純化,洗脫液為二氯甲烷 /甲醇 (V/V)=40∶1,得到白色至淡黃色油狀液體 (3c)2.0 g,收率約為60%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.14～1.19(br s,14H),1.19～1.25(t,1H,),1.43～1.49(m,4H),2.45～2.52(q,2H),2.82～2.87(br s,1H),3.32～3.39(t,2H),3.45～3.67(m,12H);ESI(m/z)：359.4[M+Na]+。

1.2.4 11-十一烷基-三乙烯基乙二醇二硫((1-Mercaptoundec-11-yl)tri(ethylene glycol)disulfide 2))(3d)的制備 將 (3c)1.5 g溶于35 ml甲醇,加入碘 2 mmol,室溫反應(yīng),薄層色譜 (TCL)檢測至反應(yīng)終止。減壓濃縮,乙酸乙酯溶解,然后用硫代硫酸鈉飽和溶液洗滌,至水層溶液澄清為止。減壓濃縮,得橙黃色蠟狀固體,硅膠柱色譜分離純化,洗脫液為二氯甲烷/甲醇 (V/V)=100∶1至 70∶1,梯度洗脫 ,得到白色至淡黃色蠟狀固體 (3d)1.1 g,收率為 79%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.25(br s,28H),1.53～1.67(m,8H),2.62～2.69(t,4H),3.38～2.44(t,4H),3.48～3.67(m,24H),3.67～3.74(m,2H);13C NMR(300 MHz,CDCl3)δ72.55,71.54,70.59,70.57,70.33,70.00,61.68,39.15,29.54,29.50,29.47,29.45,29.20,29.16,29.81,28.51,26.05;ESI(m/z)：693.8[M+Na]+。

1.3 13-nm膠體金顆粒的合成 此方法是由Frens在 1973年創(chuàng)立[17],程序簡單,制備的膠體金顆粒大小均勻,故應(yīng)用十分廣泛。本研究采用超純水 (18.2MΩ·cm)將氯金酸 (HAuCl4)配制成溶液 (1 mmol/L,500 ml),加熱、中速攪拌至沸騰,快速加入檸檬酸三鈉溶液 (38.8 mmol/L,50 ml),快速強力攪拌,溶液顏色由亮黃色漸漸變成酒紅色,繼續(xù)反應(yīng) 15 min,停止反應(yīng)冷卻至室溫,4℃保存。透射電子顯微鏡(TEM)檢查其粒徑及均勻度,并紫外-可見光(UV-Vis)光譜掃描其最大吸收,并與雙標(biāo)記的膠體金顆粒進行比較。

1.4 膠體金納米探針的制備 采用文獻報道方法[18-19],將一端帶有巰基修飾的寡核苷酸片段組裝到膠體金表面,并將合成的三甘醇二硫化物分子也組裝到膠體金顆粒表面,制成雙功能化納米探針。其制備過程見圖 1a。取按上述方法制備的膠體金溶液 2 ml,加入超純水溶解的 1.5μmol/L H1N1-DNA(表 1)溶液 200 μl,室溫 (25℃)下輕輕振搖 24 h(20 r/min)。然后,加入磷酸緩沖溶液 1(PBS1：0.3 mol/L NaCl,10 mmol/L phosphate buffer(PB),pH 7.0),使體系 NaCl濃度至 0.1 mol/L,輕輕振搖36 h。再加入三甘醇二硫分子 (其加鈉分子離子峰質(zhì)核比 (m/z)為 693)10μl(100 mmol/L,乙醇配制),繼續(xù)輕輕振搖 12 h,即得雙功能化的膠體金納米探針 (NPs),也可稱為識別探針。4℃保存。識別探針臨用前,高速 (12 000 r/min)、低溫 (4℃)離心 25 min,除去上清液,以磷酸緩沖液 (PBS2：0.1 mol/L NaCl,10mmol/L PB,pH 7.0)洗滌 3次,最后分散于 PBS1溶液中,待用,其濃度大約為 5 nmol/L。

1.5 捕捉探針的制備[10-11]其制備過程見圖1b。取 2.8μm表面修飾氨基基團的磁性微球(30 mg/ml)300μl,二甲亞砜 (DMSO)洗滌,加入偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺 (S MPB)使氨基基團活化,加入一端帶有巰基修飾的寡核苷酸片段(表 1),室溫振搖 10 h,用磷酸緩沖液 3(0.15 mol/L NaCl,0.1 mol/L PB,pH 7.0)洗滌 ;再加入72μmol/L鈍化 DNA 100μl(表 1),繼續(xù)振搖 10 h,用磷酸緩沖液 4(0.2 mol/L NaCl,10 mmol/L PB,pH 7.0)洗滌,最終分散于 2 ml 0.3 mol/L NaCl,10 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2)中,即得捕捉探針,其濃度為 4.5 g/L,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 組裝在探針表面的寡核苷酸及靶目標(biāo)的序列Table 1 Oligonucleotide strands sequences ofmodified probes and different targets

圖1 雙標(biāo)記膠體金納米探針和捕捉探針的制備過程Fig.1 Preparation of the NPs and theMPs

圖2 形成“三明治”夾心式復(fù)合物的過程Fig.2 “Sandwich”the process of sandwich-type complexes

1.6 “三明治”夾心式復(fù)合物的形成 其過程見圖 2。向含有 30μl靶目標(biāo) (表 1)溶液 (其濃度為 10 nmol/L)的體系中依次加入 50μl捕捉探針和 50μl識別探針,再加入飽和氯化鈉磷酸溶液 (用磷酸緩沖液 1配制,濃度大約為 6 mol/L,25℃),45℃溫孵 10 min,室溫輕輕振搖 1 h,洗滌,最終用10μl超純水分散。

1.7 質(zhì)譜測定 將上述夾心式復(fù)合物溶液在 75℃溫孵 5 min,觀察顏色變化,同時取上清液質(zhì)譜測定。MALD I TOF MS的檢測條件為：離子源 1和離子源 2的加速電壓分別為 25 kV和 21.55 kV,線性正離子掃描模式,棱鏡的加速電壓為 9.5 kV,反射元件 1和反射元件 2的加速電壓分別為 26.3 kV和 13.85 kV,最適激光強度為30%。用 2μl的去雜交產(chǎn)物點靶(Anchor-Chips,400/385)。以 15個單位的腺嘌呤 (A15)自組裝的膠體金顆粒作為基質(zhì),檢測二硫化物分子的加鈉分子離子峰 ([M+Na]+),其質(zhì)核比 (m/z)為 693。

1.8 探針特異性和靈敏度考察探針的特異性和靈敏度對評價探針質(zhì)量優(yōu)劣十分重要。為考察探針的特異性,本研究同時進行如下實驗：向含有 50μl捕捉探針和 50μl識別探針的體系中,分別加入 30μl濃度均為 10 nmol/L的完全匹配 DNA、完全不匹配 DNA、與捕捉探針有 1個堿基不匹配的 DNA、與識別探針有 1個堿基不匹配的 DNA(表 1)和超純水 (作為空白對照),按上述方法進行實驗,觀察反應(yīng)體系顏色變化 ,并 MS測定。

為考察膠體金納米探針的靈敏度,本研究進行了 5個不同靶 DNA濃度包括 0 mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L的實驗,每個濃度平行實驗 3次。其他實驗過程同特異性實驗。

2 結(jié) 果

2.1 TEM及 UV-Vis檢測結(jié)果

TEM顯示檸檬酸鈉還原法制備的膠體金顆粒,其粒徑介于 12～14 nm(圖 3A),粒徑均勻,分散度好,這對進行修飾是一個很好的基礎(chǔ)。曾有文獻報道膠體金顆粒在高達 1 mol/L的氯化鈉溶液、磷酸緩沖液、硼酸溶液、丙磺酸溶液或者含有金屬離子和小分子的溶液等多種體系中都具有良好的穩(wěn)定性[9,20],但適宜的離子濃度及溫度對于膠體金保持良好分散,減少聚集是很重要的。從圖 3A和圖 3B可知,未經(jīng)標(biāo)記的膠體金顆粒表面光滑,界面清晰;而經(jīng)標(biāo)記的膠體金顆粒則表面模糊,周圍長滿灰色的“絨毛”,表明 H1N1寡核苷酸片段及二硫化物分子已標(biāo)記到膠體金顆粒表面。且如圖 3所示雙標(biāo)記的膠體金納米探針并未使膠體金顆粒發(fā)生聚集,仍可穩(wěn)定存在,分散性好。另外,膠體金顆粒的光譜特性也可說明其制備質(zhì)量優(yōu)劣及標(biāo)記效果。膠體金隨粒徑的增大,對應(yīng)吸收峰的峰位呈現(xiàn)向長波段紅移的趨勢[21]。對于 13-nm的膠體金顆粒,其最大吸收波長在 520 nm左右。從圖 3c的 UV-Vis光譜掃描圖可以看出,進行雙標(biāo)記的膠體金納米探針其最大吸收峰的波長紅移了大約 2.0 nm(標(biāo)記前后最大吸收峰波長分別是 520和 522 nm)。并且從圖中可以看出經(jīng)過雙標(biāo)記的膠體金同未經(jīng)標(biāo)記的膠體金相比,其 UV-Vis光譜掃描圖圖形較平坦,這些都充分說明H1N1寡核苷酸鏈及二硫化物分子已標(biāo)記到膠體金顆粒的表面,使納米金粒子尺寸和形狀有所改變,從而改變了膠體金顆粒的光譜學(xué)特征。

2.2 探針特異性考察結(jié)果 雙標(biāo)記的膠體金納米探針呈鮮艷的酒紅色,和捕捉探針遇到靶 DNA時,按照堿基互補原理形成“捕捉探針-靶 DNA-識別探針”夾心式復(fù)合物,此時識別探針的酒紅色褪去,反應(yīng)體系呈無色。加熱去雜交破壞夾心式結(jié)構(gòu),使識別探針 (即雙功能化的納米探針)從夾心式結(jié)構(gòu)中釋放出來,此時體系復(fù)呈酒紅色,MALD I TOF MS測定在 m/z 693的位置有 1個三甘醇二硫分子的加鈉分子離子峰 ([M+Na]+)(圖 4b)。當(dāng)加入超純水作為空白對照實驗 (圖 4a)和加入完全不匹配 DNA(圖 4c)及 2條僅有 1個堿基不匹配的 DNA(圖 4d和圖 4e)實驗中,溫孵雜交后體系仍然呈現(xiàn)酒紅色;去雜交后,反應(yīng)體系也不會顯酒紅色;同樣,MALD I TOF MS測定在 m/z 693的位置也沒有峰出現(xiàn),這是因為夾心式復(fù)合物沒有形成,說明 2種探針的特異性很好,可以區(qū)分僅有 1個堿基不匹配的 DNA。2.3 探針靈敏度考察結(jié)果 捕捉探針與雙標(biāo)記的膠體金納米探針遇到一系列不同濃度的靶DNA進行探針靈敏度實驗。由圖 5可知,按照堿基互補原理形成“捕捉探針-靶DNA-識別探針”夾心式復(fù)合物,加熱去雜交破壞夾心式結(jié)構(gòu),使識別探針從夾心式結(jié)構(gòu)中釋放出來,采用MALD I TOFMS測定二硫化物分子的加鈉分子離子峰 ([M+Na]+),其質(zhì)核比 m/z為 693。這種檢測靶 DNA方法的靈敏度可達 1 pmol/L(10-12mol/L)。

圖3 13-nm膠體金顆粒經(jīng) H1N1寡核苷酸片段和二硫化物分子雙標(biāo)記制成膠體金納米探針前后比較Fig.3 Comparision of 13-nm golden colloid particles without and with dual-functionalized with single-strand oligonucleotide of influenza A virus(H1N1) and disulfide molecules

圖4 捕捉探針和識別探針特異性考察結(jié)果Fig.4 Specification investigation results of theMPs and the NPs

圖5 膠體金納米探針的靈敏度實驗結(jié)果Fig.5 The sensitivity results of colloidal gold nano-probe

3 討 論

二硫化物以及膠體金的合成會影響雙功能化膠體金納米探針的制備。本研究使用的三甘醇二硫分子在其合成的第三步產(chǎn)生的是巰基化合物,因其自身不穩(wěn)定傾向于兩兩分子連接成二硫化物,且此巰基化合物的膠體金自組裝效果不佳;而在第四步氧化成二硫分子后,此化合物穩(wěn)定性提高,與膠體金的結(jié)合效果較好。故選擇二硫化物分子而非第三步產(chǎn)生的巰基化合物作為標(biāo)記物。目前,對于含硫小分子與膠體金之間的結(jié)合到底是化學(xué)鍵還是靜電引力,還不是很清楚。另一方面,在膠體金合成過程中,加入不同量的還原劑可制成粒徑大小不同的膠體金顆粒。影響膠體金質(zhì)量的因素主要包括：反應(yīng)物的濃度、反應(yīng)攪拌混勻程度、反應(yīng)物加料順序、反應(yīng)溫度、反應(yīng)器的材料及反應(yīng)物的純凈度,尤其是水。其中,反應(yīng)物攪拌混勻程度是至關(guān)重要的一個因素。另外,在反應(yīng)結(jié)束后冷卻的過程中,繼續(xù)強力攪拌也有助于膠體金粒徑均勻,分散性好。

在本研究中,組裝到金納米粒子表面的寡核苷酸片段具有特異性識別靶目標(biāo) DNA的功能,可稱之為識別分子;組裝到金納米粒子表面的三甘醇二硫分子,其不但可作為與靶 DNA對應(yīng)和指示靶目標(biāo)存在的質(zhì)量條碼 (reporter masscode)被質(zhì)譜檢測,而且因其數(shù)量遠遠大于表面DNA的數(shù)量,對靶目標(biāo)具有信號放大功能,可稱其為編碼分子。另外,選擇磁性微球制備成的捕捉探針作為固相支持物,它通過堿基互補配對原理從被分析物中“抓出”靶目標(biāo),再與膠體金納米探針形成捕捉探針-靶目標(biāo)-膠體金納米探針的“三明治”夾心式復(fù)合物。所以,捕捉探針具有分離靶目標(biāo)、純化夾心式復(fù)合物和富集靶目標(biāo)的作用,對本方法檢測靈敏度的提高尤為重要。曾有文獻報道[22],采用膠體金納米探針進行 DNA檢測,其檢測靈敏度可達z M水平。因其靈敏度高,DNA檢測不需要PCR擴增。本研究建立的制備雙功能化膠體金納米探針在實驗條件未經(jīng)任何優(yōu)化的條件下,靈敏度可達 1 pmol/L水平 (圖 5)。本課題組今后的工作將集中在如何提高檢測靈敏度,使其成為可以應(yīng)用于臨床的基因分析手段。提高檢測靈敏度的方法主要包括下面 2個方面：一是提高納米探針表面編碼分子和識別分子的比例,兩者的比例就是靶 DNA信號擴大的倍數(shù);二是提高雜交效率,這步可通過提高反應(yīng)體系的鹽離子濃度完成。但是,對于一個表面積固定的膠體金顆粒,隨著其表面編碼分子數(shù)量的增加,與靶DNA互補配對的識別分子的數(shù)量必將減少,加之空間位阻的影響,雜交效率會降低[22]。因此,這需要對雜交條件、膠體金納米探針的標(biāo)記等多方面綜合考慮進一步優(yōu)化,才可得到較高的檢測靈敏度。

為考察制備的新型膠體金納米探針的特異性,本研究將其與不同的靶目標(biāo)進行了雜交實驗。結(jié)果顯示,探針除可以與完全匹配 DNA進行雜交形成夾心式復(fù)合物,產(chǎn)生顏色變化,質(zhì)譜測定出現(xiàn)信號外,其他不同形式的靶目標(biāo),尤其是僅有 1個堿基突變的靶 DNA序列,包括與捕捉探針序列 1個堿基錯配和與識別探針序列 1個堿基錯配兩種情況,均不能與探針進行雜交形成夾心式復(fù)合物,反應(yīng)體系無顏色變化,質(zhì)譜測定未見信號。這充分說明本研究制備的膠體金納米探針具有很高的特異性,這對基因分析,尤其是在臨床診斷上意義重大。綜上所述,本研究建立了在膠體金表面同時組裝二硫化物分子和寡核苷酸鏈制備成雙功能化膠體金納米探針的方法,磁性微球制成的捕捉探針與靶目標(biāo)形成“三明治”夾心式復(fù)合物,采用MALD I TOF MS檢測的新方法有如下優(yōu)點：實驗原理通俗易懂,探針制備操作簡單、靈敏度高、特異性高。其靈敏度在探針制備方法和雜交體系未經(jīng)優(yōu)化的情況下,達到 10-12mol/L水平;其特異性高,能區(qū)分靶目標(biāo)序列中僅有 1個堿基錯配的 DNA序列,這對 DNA檢測尤為重要。因此,采用膠體金納米探針進行基因分析的方法將具有更廣闊的應(yīng)用前景。另外,本研究建立的檢測甲型流感病毒的方法,可以為甲型流感病毒的臨床早期快速診斷提供一個新思路與新方法。

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[責(zé)任編輯 黃曉花 ]

Self-assembly of dual-functionalized gold nanoparticle probe and its specificity

YANGBing,HUANGLe-qun(M edical School,N anjing University,Nanjing210093,China)

Objective：To investigate the specificity of the dual-functionalized nanopaticle probes(NPs)self-assembled with colloidal gold.M ethods：13-nm gold nanoparticleswere preparedwith citrate reduction of HAuCl4.These gold nanoparticles were sequentially functionalized with the specific singlestrand oligonucleotide of HA gene of influenza A virus(H1N1)and disulfide molecules of m/z at 693.The NPs solution showed the red for mation.The magnetic microparticles(MPs)were modified with another specific single-strand oligonucleotide in HA gene of H1N1.The sandwich complexes(MP-Target-NPs)were for med by the target DNA with the MPs and the NPs.The color change in the solution was observed and the dehybridization product was detected by MALD I TOF MS.Moreover specificity of the probeswas investigated with nanowater(as a blank control)and the different target DNAs including complementary DNA,non-complemetary DNA and two DNAs of one base mismatch,respectively.Results：The red formation and the positive signal in MS detection of reporter mass code 693([M+Na]+)were observed,which indicated the formation of sandwich complexes for med only when the completely complementary targetDNAswere presented in the solution.No color for mation changes and no peak signal detected byMALD I TOFMSwere observed,showing that none of target of interest(nanopure water),non-complementary DNA and two DNAs of one base mis match existed in the systems,which indicated no sandwich complexes formed be tween the target DNAs and the two probes.Conclusions：Considering the simple preparation procedure and high specificity,the dual-functionalized gold nanoparticle probeswould be widely and increasingly used in nucleic acid analysis.In particular,itwould have broad application prospects in early diagnosis of diseases,single nucleotide polymorphis m (SNP)typing and so on.

Nucleic acid probes;Gold colloid;Magnetics;Microspheres;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization;Nanotechnology

2010-01-20

2010-03-20

國家教育部歸國華僑學(xué)者科研基金(No.0214168001).

楊 冰 (1975-),女,博士,從事藥物分析研究.

黃樂群 (1955-),男,博士,教授,從事分析化學(xué)研究;E-mail：huanglq@nju.edu.cn.

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2010.03.014

Q 67;Q 781

A

1008-9292(2010)03-0296-09