中把大蕉淀粉的穩(wěn)定性及酶解動力學(xué)

夏 雨，徐 勇,2，李燕杰，袁根良，杜 冰，楊公明,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省食品工業(yè)研究所，廣東 廣州 510308)

中把大蕉淀粉的穩(wěn)定性及酶解動力學(xué)

夏 雨1，徐 勇1,2，李燕杰1，袁根良1，杜 冰1，楊公明1,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省食品工業(yè)研究所，廣東 廣州 510308)

以差示掃描量熱法(DSC)和酶水解法研究中把大蕉(Musa×paradisiaca L.)淀粉對熱、酸、堿及淀粉酶的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：中把大蕉粉主要成分為淀粉，約占干基質(zhì)量的78%左右，是一種理想的天然抗性淀粉來源；其糊化起始溫度To為72.10℃、峰值溫度Tp為77.56℃和結(jié)束溫度Tc為80.40℃，糊化焓ΔH為9.698J/g；最大耐酸濃度為0.001mol/L；最大耐堿濃度為0.01mol/L。以中把大蕉淀粉的酶解曲線為基礎(chǔ)，采用Wilkinson統(tǒng)計法求解米氏常數(shù)得出：Vm=0.4426mg/(mL·min)，Km=6.566mg/mL，即中把大蕉淀粉的酶解動力學(xué)方程為：V=0.4426×[S]/(6.566+[S])。

中把大蕉；淀粉；熱穩(wěn)定性；酸解穩(wěn)定性；堿溶穩(wěn)定性；酶解動力學(xué)

香蕉是熱帶、亞熱帶特色水果，具有潤腸通便、提高機(jī)體免疫力、抗癌抗腫瘤、保護(hù)心血管、抗氧化、治療抑郁癥等眾多生理功能，被譽(yù)為“新的水果之王”[1]。香蕉屬于芭蕉科芭蕉屬真蕉亞屬，分為香牙蕉、大蕉、粉蕉和龍牙蕉4個類型[2]。中把大蕉(Musa× paradisiaca L.)，不僅產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)，且抗性淀粉含量高，是天然抗性淀粉的理想來源。其假莖高2.3～3m，莖粗，果穗長，果指長，果形直且起棱，后熟皮較厚，色淡黃或土黃，肉質(zhì)柔滑，甜帶微酸，無香味[3]。中把大蕉是華南地區(qū)廣泛種植的品種，除果穗中間部分可作為商品蕉銷售外，兩端部分常被廢棄，采后損失十分嚴(yán)重[4]。Torre-Gutierrez等[5]以青蕉為原料提取制得高純度的大蕉淀粉，呈橢圓形，直鏈淀粉含量為22.2%，支鏈淀粉含量為77.8%。Zhang等[6]認(rèn)為香蕉淀粉屬于低直鏈淀粉、高蛋白產(chǎn)品，富含抗性淀粉，有極好的生理功能。趙國建等[7]指出天然香蕉淀粉的晶體類型屬于C型。Mota等[8]指出不同品種香蕉粉的主要組成為淀粉，糊化溫度在68～76℃之間。Gonzalez-Soto等[9]利用雙螺桿擠壓膨化對香蕉粉進(jìn)行預(yù)糊化，再冷藏來增加抗性淀粉含量，以提高香蕉粉的保健功能。Aparicio-Saguilana等[10]添加15%的香蕉粉來制備慢速消化餅干，相比于空白對照77.62%的淀粉水解率，添加后淀粉水解率為60.53%，可有效減緩餅干中淀粉的消化速度。因此，利用殘次蕉加工成富含抗性淀粉的功能性食品配料，在加工中盡量減少天然抗性淀粉的降解，可使最終產(chǎn)品具有抗性淀粉的保健功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中把大蕉(Musa×paradisiaca L.)購于番禺萬傾沙農(nóng)場，位于廣州市中南部，屬南亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年均降水量1900mm，年均溫21.6℃，處于北緯22°45′～23°05′、東經(jīng)113°14′～113°34′之間。

檸檬酸 東莞市華宏化工有限公司；VC 北京嘉源化工有限公司；亞硫酸氫鈉 廣州市東紅化工廠；3,5-二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚天津市化學(xué)試劑一廠；亞硫酸鈉 江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；中溫α-淀粉酶(M0003) 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；糖化復(fù)合酶(糖化酶+普魯蘭酶，3×104U)廣州裕立寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2860型打漿機(jī) 飛利浦有限公司； TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；103型高速中藥粉碎機(jī) 瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；100目國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；YP6000電子天平 上海第二天平儀器廠；pH S-25酸度計 上海雷磁儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；752N分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

中把大蕉全粉制備工藝流程：市購中把大蕉→清洗→去皮→護(hù)色處理→打漿→離心脫水→低溫干燥→粉碎→過100目篩→中把大蕉全粉→包裝成品。

1.3.2 中把大蕉粉組分分析

水分含量測定：按照GB/T 12087—2008《淀粉水分測定 烘箱法》，重復(fù)3次取平均值；淀粉含量測定：按照GB/T 5514—2008《糧油檢驗 糧食、油料中淀粉含量測定》，重復(fù)3次取平均值；膳食纖維含量測定：按照GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》，重復(fù)3次取平均值。

1.3.3 中把大蕉淀粉穩(wěn)定性分析

1.3.3.1 中把大蕉淀粉熱穩(wěn)定性分析

用去離子水準(zhǔn)確配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的淀粉溶液(按干基計)，以微量進(jìn)樣器加入到DSC坩堝中，坩堝加蓋密封，以空皿作為參比，然后以5℃/min的速率升溫，溫度范圍30～100℃。

1.3.3.2 中把大蕉淀粉酸解穩(wěn)定性分析

稱取2.0g中把大蕉淀粉，分別加入濃度為10.0、1.0、1.0 ×10-1、1.0 ×10-2、1.0 ×10-3、1.0 ×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol/L的鹽酸溶液，在室溫下振蕩30min，于3000r/min離心10min，用DNS法測定上清液中還原糖含量[11]，并計算中把大蕉淀粉的保留率，重復(fù)3次取平均值。

1.3.3.3 中把大蕉淀粉堿溶穩(wěn)定性分析

稱取2.0g中把大蕉淀粉，分別加入10.0、1.0、1.0 ×10-1、1.0 ×10-2、1.0 ×10-3、1.0 ×10-4、1.0 ×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol/L的氫氧化鈉溶液，在室溫下振蕩30min，于3000r/min離心10min，用DNS法測定上清液中還原糖含量，計算中把大蕉淀粉的保留率；稱取沉淀質(zhì)量，計算中把大蕉淀粉的膨脹率，重復(fù)3次取平均值。

1.3.4 中把大蕉淀粉酶解動力學(xué)模型

取質(zhì)量濃度為20mg/mL中把大蕉淀粉溶液1mL，加入pH6.0的磷酸緩沖溶液2.0mL，搖勻后于50℃水浴中保溫預(yù)熱5min，加1.0mL α-淀粉酶液，使反應(yīng)液的酶活力達(dá)到5U/mL，反應(yīng)5min后取出，沸水浴5min鈍化酶，于3000r/min離心10min，取上清液用DNS法測定還原糖含量。用Excel軟件通過雙倒數(shù)法[12]和Wilkinson統(tǒng)計法[13]求解米氏常數(shù)，推導(dǎo)出中把大蕉淀粉酶解的動力學(xué)方程。

1.3.5 計算

1.3.5.1 淀粉水解率的計算

根據(jù)DNS法測定的還原糖含量，按下式折算為淀粉當(dāng)量計算淀粉水解率，公式如式(1)。

式中：0.9為還原性葡萄糖與淀粉換算率。

1.3.5.2 淀粉保留率及膨脹率的計算

根據(jù)DNS法測定的還原糖含量，按下式折算為淀粉當(dāng)量計算淀粉保留率，公式如式(2)。

式中： 0.9為還原性葡萄糖與淀粉換算率。

1.3.5.3 淀粉水解速率的計算

根據(jù)DNS法測定的上清液中還原糖的含量，按下式計算反應(yīng)5min時的反應(yīng)速率V。每組實驗重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中把大蕉粉基本組成分析

按照國標(biāo)方法分別測定中把大蕉粉中水分、淀粉和膳食纖維含量，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成如圖1所示。

圖1 干制中把大蕉全粉基本組成成分Fig.1 Basic compositions of plantain powder

從圖1可知，中把大蕉粉的主要成分為淀粉，約占總質(zhì)量的78%。其次為水分和膳食纖維，分別占總質(zhì)量的10%和9%，其他成分約占3%。Juarez-Garcia等[14]以青蕉制得的香蕉粉中淀粉含量為73.36%，纖維素含量為14.52%。因此，以中把大蕉為原料制得的中把大蕉粉主要成分為淀粉和膳食纖維，經(jīng)測定其中富含天然抗性淀粉，可作為一種功能性保健食品的原輔料。

2.2 中把大蕉淀粉的穩(wěn)定性研究

2.2.1 中把大蕉淀粉的熱穩(wěn)定性分析

圖2 20%中把大蕉淀粉溶液的DSC熱分析曲線Fig.2 DSC thermal analysis curve of 20% starch solution

從圖2可知，大蕉淀粉的糊化起始溫度To為72.10℃、峰值溫度Tp為77.56℃，結(jié)束溫度Tc為80.40℃，糊化焓ΔH為9.698J/g。朱帆等[15]利用DSC法研究小麥淀粉與面粉糊化和回生特性得出，小麥淀粉糊化起始溫度To為56.90℃、峰值溫度Tp為62.70℃，結(jié)束溫度Tc為71.30℃，糊化焓ΔH為6.50J/g。因此，中把大蕉淀粉比小麥淀粉具有更高的糊化溫度和糊化焓，即中把大蕉淀粉的熱穩(wěn)定性優(yōu)于小麥淀粉，其最高耐受溫度為72.10℃。

2.2.2 中把大蕉淀粉的酸解穩(wěn)定性分析

中把大蕉淀粉在不同濃度的鹽酸溶液中酸解30min后，其水解率和保留率結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酸濃度下中把大蕉淀粉的水解率和保留率Fig.3 Hydrolysis rate and retention rate of plantain starch under acidic solutions with various concentrations

從圖3可知，隨著鹽酸濃度的增大，中把大蕉淀粉水解率先趨于平緩后呈急劇增大趨勢，而保留率先趨于平緩后呈下降趨勢。在強(qiáng)酸作用下中把大蕉淀粉顆粒發(fā)生降解，大分子淀粉降解為小分子單糖。周小柳等[16]利用酸法制備玉米微孔淀粉，在鹽酸的作用下玉米淀粉沿著徑向逐步向顆粒中心推進(jìn)，同時小孔孔徑逐漸擴(kuò)大，形成空洞結(jié)構(gòu)，且顆粒仍保持基本形狀。因此，當(dāng)鹽酸濃度大于0.001mol/L時淀粉顆粒表面開始被酸降解，小分子糖含量增加，中把大蕉淀粉對酸的最大耐受濃度為0.001mol/L。

2.2.3 中把大蕉淀粉的堿溶穩(wěn)定性分析

中把大蕉淀粉在不同濃度的氫氧化鈉溶液中，室溫振蕩30min后，其膨脹率和水解率見圖4。

圖4 不同NaoH濃度下中把大蕉淀粉的水解率和膨脹率Fig.4 Hydrolysis rate and expansion rate of plantain starch under alkaline solution with various concentrations

從圖4可知，隨著氫氧化鈉濃度的增大，中把大焦淀粉膨脹率呈增大趨勢，而水解率始終保持較小狀態(tài)，呈微弱的下降趨勢。田景霞等[17]利用酒精堿法制備顆粒冷水可溶甘薯淀粉指出，氫氧化鈉溶液濃度低，淀粉顆粒不能充分溶脹，其雙螺旋結(jié)構(gòu)解離得少，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)完整；隨著氫氧化鈉溶液濃度的逐漸增加，淀粉顆粒充分溶脹，其雙螺旋結(jié)構(gòu)解離，淀粉顆粒被破壞。因此，中把大焦淀粉顆粒開始溶脹、雙螺旋結(jié)構(gòu)開始解離的氫氧化鈉濃度為0.01mol/L，中把大焦淀粉對堿的最大耐受濃度為0.01mol/L。

2.3 中把大蕉淀粉的抗酶解特性

2.3.1 中把大蕉淀粉的酶解特性

分別吸取質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18mg/mL的中把大蕉淀粉溶液1mL，加入pH6.0的磷酸緩沖溶液2mL，預(yù)熱5min后，加入20U/mL的中溫α-淀粉酶液1.0mL，在50℃條件下進(jìn)行水解實驗，測定反應(yīng)速率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)速率與中把大蕉淀粉質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.5 Relationship between reaction velocity and plantain starch concentration

從圖5可以看出，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，淀粉的酶解速率先急劇上升后趨于平緩。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度小于10mg/mL時，酶解速率隨著底物質(zhì)量濃度呈線性增加；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于10mg/mL后，酶解速率趨于平緩。Faisant等[18]對青香蕉粉中的抗性淀粉在健康人體小腸內(nèi)的消化特性進(jìn)行研究表明，83.7%的香蕉粉可以順利通過小腸，只有顆粒表面16.3%的淀粉能被淀粉酶作用。

2.3.2 中把大蕉淀粉的酶解動力學(xué)模型

Michealis-Menten提出的酶促反應(yīng)按下列兩步進(jìn)行：

即酶(E)與底物(S)首先結(jié)合成中間產(chǎn)物(ES)，中間產(chǎn)物分解成產(chǎn)物(P)后酶重新游離出來。在酶促反應(yīng)初期，沒有或極少含有產(chǎn)物(P)，不足以引起可逆反應(yīng)，k4可以忽略不計，故第二步反應(yīng)是單向的。由質(zhì)量守恒定律可得到反應(yīng)的動力學(xué)模型：

式中：[S]為底物濃度/(mol/L)；[Et]為總酶濃度/(mol/L)。

方程(6)即為α-淀粉酶水解中把大蕉淀粉的米氏方程。式中的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vm)是酶促反應(yīng)的兩個重要的動力學(xué)參數(shù)。Km/(mol/L)＝(k2+k3)/k1，相當(dāng)于酶的活性部位一半被底物占據(jù)時所需的底物濃度，Vm/(mol/(L·min))＝k3[Et]，表示在酶濃度不變時，酶被底物飽和，反應(yīng)速率達(dá)到最大[12]。

圖6 lnV-ln[S]關(guān)系圖Fig.6 Plot of lnV-ln[S]

由lnV對ln[S]作圖得到圖6所示直線，可以認(rèn)為在加酶后很短的時間內(nèi)α-淀粉酶降中把大蕉淀粉遵循一級反應(yīng)規(guī)律[12]。由圖6的直線可以看出，V對[S]呈典型的雙倒數(shù)曲線關(guān)系，符合經(jīng)典表征酶促反應(yīng)特征的Michealis-Menten方程所繪制的曲線形狀，這表明α-淀粉酶對中把大蕉淀粉的降解遵循Michealis-Menten規(guī)律，可用Michealis-Menten方程對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

2.3.3 動力學(xué)模型參數(shù)求解

2.3.3.1 Lineweaver-Burk(雙倒數(shù)作圖法)[12]

圖7 淀粉酶水解中把大蕉淀粉的Lineweaver-Buck圖Fig.7 Lineweave-burk plot for plantain starch hydrolyzed by amylase

表1 Wilkinson法求估算解Table 1 Calculation of provisional value by Wilkinson method

以1/V對1/[S]作圖，得到圖7所示的各對應(yīng)點。用最小二乘法線性擬合，可以求得Vm＝0.4224mg/(mL·min)，Km＝5.9533mg/mL?；貧w方程為：

方程的相關(guān)系數(shù)r=0.9913，方程極顯著。

2.3.3.2 Wilkinson統(tǒng)計法求解米氏常數(shù)

Wilkinson統(tǒng)計法包括非線性二乘法求估算解和泰勒展開式求精校解[19]，計算過程如表1所示。

由表 1 可得，Δ =α ε－γ δ=7.94563 × 10-6，

2.3.4 兩種方法求解擬合得到的數(shù)據(jù)比較

表2 Lineweaver與Wilkinson求解結(jié)果比較Table 2 Comparison of calculation results between Linweaver and Wilkinson method

這兩種方法求得的Vm和Km值都十分相近，但也存在一定的差別。這是因為用Lineweaver求解要求[S]在0.33～2.0Km的實驗結(jié)果時才能比較準(zhǔn)確；如果所選底物濃度比Km大得多時，所得雙倒數(shù)圖的直線基本上是水平的，這種情況可以測得Vm，而Km不能準(zhǔn)確測得；如果[S]比Km小得多時，所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點都接近原點，Km和Vm都難以測準(zhǔn)，而Wilkinson法可以克服這些問題，所測得的兩個動力學(xué)參數(shù)比較可靠[19]。

3 結(jié) 論

通過對中把大蕉粉基本組成分析可知，中把大蕉粉以淀粉為主，是一種理想的天然抗性淀粉來源，可作為功能性保健食品原、輔料。對中把大蕉淀粉進(jìn)行穩(wěn)定性分析后得出：中把大蕉淀粉的糊化起始溫度To為72.10℃、峰值溫度Tp為77.56℃ 和結(jié)束溫度Tc為80.40℃，糊化焓ΔH為9.698J/g；最大耐酸濃度為0.001mol/L，最大耐堿濃度為0.01mol/L。以中把大蕉淀粉的淀粉酶解曲線為基礎(chǔ)，采用Wilkinson統(tǒng)計法求解米氏常數(shù)得出：Vm=0.4426mg/(mL·min)，Km=6.566mg/mL。即可得出中把大蕉淀粉的酶解動力學(xué)方程為：V=0.4426×[S]/(6.566+[S])。

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Stability and Enzymatic Kinetics of Plantain Starch

XIA Yu1，XU Yong1,2，LI Yan-jie1，YUAN Gen-liang1，DU Bing1，YANG Gong-ming1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2. Guangdong Food Industry Institute, Guangzhou 510308, China)

In order to provide theoretical references for the development and application of plantain natural resistant starch,the stability of plantain starch to heat, acid, alkali and amylase was investigated. Results indicated that principal constituent of plantain powder was starch with total amount of 78%. The plantain starch was one of ideal sources of natural resistant starch.Its initial, peak and final gelatinization temperatures were 72.10, 77.56 ℃ and 80.40 ℃, respectively. Its gelatinization enthalpy was 9.698 J/g. The maximum concentrations of plantain starch to resist acid and alkali were 0.001 mol/L and 0.01 mol/L, respectively.Based on the enzymatic hydrolysis curve of plantain starch, an enzymatic kinetic equation, V = 0.4426 × [S]/(6.566 + [S]), was deduced by the Wilkinson method, with Vm and Km of 0.4426 mg/(mL·min) and 6.566 mg/mL, respectively.

plantain starch；thermal stability；acid-hydrolyzing stability；alkali-dissolving stability；enzymatic kinetics

TS235.9

A

1002-6630(2010)09-0074-06

2009-09-03

粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點突破項目(200849861007)；廣東省食品工業(yè)公共實驗室開放課題(FIPL-07-007)

夏雨(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品加工與保藏。E-mail：xiayu1984@foxmail.com

楊公明(1950—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工新工藝與裝備。E-mail：ygm@scau.edu.cn