鐵蛋白重鏈多肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

杜軍偉,王遠(yuǎn)志,陳創(chuàng)夫,葛陽(yáng)春

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003;2新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

鐵蛋白重鏈多肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

杜軍偉1,2,王遠(yuǎn)志2,陳創(chuàng)夫2,葛陽(yáng)春1,2

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003;2新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

為了探討鐵蛋白重鏈多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)對(duì)RAW264.7細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響,采用RNA干擾和實(shí)時(shí)定量方法進(jìn)行研究,首先提取RAW264.7細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得定量片段,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。將pSIREN-FTH1A/B轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞,48 h后用綿羊種布魯氏菌019株侵染4 h,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Mkl1、Birclb的表達(dá),GAPDH作為內(nèi)參基因,檢測(cè)干擾前后凋亡相關(guān)基因mRNA的量。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pSIREN-FTH1的細(xì)胞被布魯氏菌侵染后,Mkl1、Birclb基因mRNA的量較干擾前分別降低了76.3%、88.8%。FTH1可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)從而影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

布魯氏菌;巨噬細(xì)胞;FTH1;凋亡

Abstract:To investigate the effects of ferritin heavy chain 1(FTH1)on the transcription of apoptosis-related genes Mkl1 and Birclb in mouse macrophage cells RAW264.7.The research was carried out by means of RNAi and RT-PCR.The total mRNA was extracted.The apoptosis-related genes were aquired by RTPCR,then made standard curves of them.pSIREN-FTH1A/B was transfected into a mouse RAW264.7 macrophages.After 48 h the transfected cells were infected for 4 h by B.ovis 019 strain.The expressions of apoptosis-related genes were quantitated and compared by real-time PCR on the basis of expressions of g1yceraJdehyde-3-phosphate dehdrogenase(GAPDH)as internal control in different groups.The results showed that the pSIREN-FTH1 group could significantly inhibited Mkl1 and Birclb mRNA expressions in mouse RAW264.7 macrophages infected with B.ovis 019 strain.The inhibition rate reached to 76.3%and 88.8%,respectively.FTH1 participate apoptosis of RAW264.7 macrophages cells by regulating the transcription of Mkll and Birclb.

Key words:Brucella;macrophage;FTH1;apoptosis

布魯氏菌病是由布魯氏菌屬(Brucella)成員引起的一種慢性人畜共患傳染病,其病原為布魯氏菌,是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的致病菌,主要感染反芻動(dòng)物和人類[1-3]。

近年來,畜牧業(yè)的快速發(fā)展促使牲畜調(diào)運(yùn)頻繁,而家畜的布魯氏菌病的陽(yáng)性率呈逐年上升趨勢(shì)。為了更好的預(yù)防布魯氏菌病,唐利燕等[4]建立了和M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的配套性血清學(xué)檢測(cè)方法bp26間接ELISA法。布魯氏菌與巨噬細(xì)胞間胞內(nèi)寄生關(guān)系對(duì)于慢性布魯氏菌感染至關(guān)重要,由VirB編碼的IV型分泌系統(tǒng)對(duì)于胞內(nèi)布魯氏菌的成功復(fù)制是必需的[5]。毒力較強(qiáng)的光滑型的布魯氏菌可以抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[6]。王遠(yuǎn)志等[7]應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出了和布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)相作用的鐵蛋白重鏈多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)。鐵蛋白有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用[8],而氧化損傷是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的因素之一[9]。

本試驗(yàn)通過運(yùn)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)FTH1的表達(dá),并運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)來檢測(cè)干擾后巨噬細(xì)胞中相關(guān)凋亡基因的mRNA表達(dá)量,從而檢測(cè)FTH1在綿羊種布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞過程中是否參與了巨噬細(xì)胞的凋亡過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器

pSIREN-siRNA表達(dá)質(zhì)粒(pSIREN-FTH1A/B)由本實(shí)驗(yàn)室保存;小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);宿主菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存;B.ovis 019株由本實(shí)驗(yàn)室保存;LSM510激光共聚焦顯微鏡:新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;Smart CyclerⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR儀:Cepheid公司。

1.1.2 主要試劑

PrimeScript TM RT reagent Kit購(gòu)自大連生物工程有限公司;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自 G IBCO公司;TurboFect TM in vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol購(gòu)自 I nvitrogen公司;熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自博奧公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物

根據(jù)從 G enBank中獲得的下列基因編碼序列,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物(表1)。

實(shí)時(shí)定量引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取

收集在細(xì)胞培養(yǎng)板上生長(zhǎng)達(dá)到70%的細(xì)胞1 mL至離心管,用冷的DEPC水洗2次。

向離心管中加入1 mL TRIzol,吹打數(shù)次,室溫靜置5 min,離心,取上清至另一離心管中。

向離心管中加入0.2 mL的氯仿,顛倒15 s,室溫靜置5 min,液體出現(xiàn)分層。4℃,1.2×104r/min離心15 min,液體分層。

吸取上層水相約0.5 mL置另一離心管中,加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃靜置60 min。

4 ℃,1.2×104r/min離心15 min,棄上清,并吸干離心管中的殘液。

向離心管中加入預(yù)冷的75%的乙醇1 mL,輕彈管壁,4℃,1.2×104r/min離心15 min,棄上清。

將離心管空氣干燥10 min,加20μL DEPC水溶解RNA,取5μL用1%的變性瓊脂糖電泳檢測(cè)。

進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。

1.2.3 制定實(shí)時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)選取 GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因,分別對(duì)Mkl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH 質(zhì)粒從10-1-10-7按10倍梯度稀釋后進(jìn)行定量PCR反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 轉(zhuǎn)染pSIREN-FTH1A/B質(zhì)粒

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于12孔細(xì)胞板中,在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,用TurboFect TM in vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,試驗(yàn)將pSIREN-FTH1B轉(zhuǎn)染組設(shè)為陰性對(duì)照組。然后5%CO237℃條件下培養(yǎng)48 h,用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白。

1.2.5 B.ovis 019株侵染RAW264.7巨噬細(xì)胞

B.ovis 019株侵染小鼠巨噬細(xì)胞。細(xì)胞按50∶1的個(gè)數(shù)比進(jìn)行侵染細(xì)胞,并將侵染的RAW264.7細(xì)胞繼續(xù)置于5%CO237℃的CO2培養(yǎng)箱中侵染4 h。輕輕吸去培養(yǎng)板中的上清及懸浮細(xì)胞,加入1 mL Trizol,輕輕混勻,分裝于DEPC處理過的1.5 mL EP管中,其它步驟同1.2.2。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)凋亡相關(guān)基因

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入干擾質(zhì)粒再用布魯氏菌侵染后 ,細(xì)胞中 Mkl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH mRNA的量,將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA提取

提取RAW264.7巨噬細(xì)胞總RNA,1%的變性瓊脂糖電泳檢測(cè)可以清楚的看到28 S、18 S和5.8 S三條帶(圖1)。

圖1 總RNA提取Fig.1 Total RNA isolated

2.2 實(shí)時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

Birclb、Mkl1、16S rRNA、GAPDH 的 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率分別為 - 0.321、-0.251、-0.228和-0.22,相關(guān)系數(shù)分別為 0 .999、0.992、0.997 和0.996,符合作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求(圖2)。

圖2 凋亡相關(guān)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線Fig.2 Standard and amplification curve of apoptosis-related genes

2.3 轉(zhuǎn)染RNAi質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)

用TurboFect TM in vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在48 h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白,經(jīng)多處采集信息計(jì)算出質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率接近于100%(圖3)。

2.4 熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)凋亡相關(guān)基因

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾前后被布魯氏菌侵染的 R AW264.7 細(xì)胞中 M kl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH的 m RNA量,以相應(yīng)目標(biāo)基因檢測(cè)值/GAPDH的檢測(cè)值作為校正值,再用公式干擾效率/%=(RNAi陰性對(duì)照組 - RNAi試驗(yàn)組)/RNAi陰性對(duì)照組×100%,計(jì)算FTH1被干擾前后各個(gè)基因在布魯氏菌侵染過程中的差異:Mkl1的相對(duì)表達(dá)量降低約76.3%,Birclb的相對(duì)表達(dá)量降低約88.8%,16S rRNA的相對(duì)表達(dá)量降低約73%。

圖3 RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSIREN-siRNA表達(dá)質(zhì)粒48 h后的熒光照片F(xiàn)ig.3 The fluorescence of RAW264.7 cells transfected with pSIREN-siRNA expression plasmids

3 討論

布魯氏菌長(zhǎng)期胞內(nèi)寄生機(jī)制一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。Jimenez等[10]的研究表明,布魯氏菌胞內(nèi)寄生時(shí)新合成某些蛋白抑制了巨噬細(xì)胞的凋亡,從而避免巨噬細(xì)胞死亡崩解后,使布魯氏菌再次面對(duì)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的不利環(huán)境,從而保護(hù)布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期寄生,使其成為慢性感染的重要原因之一。He等[11]的研究結(jié)果表明,在感染4h時(shí),cd28和Gsn基因表達(dá)上調(diào),Bc031407基因表達(dá)下調(diào)。由 Gsn編碼 Gesolin通過誘導(dǎo)抗 Fas抗體、C2-cermide等產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡。新疆源布魯氏菌各個(gè)種之間的熱休克蛋白具有很強(qiáng)的保守性,該蛋白的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死也有抑制作用[12]。

鐵蛋白具有調(diào)整鐵的貯存和維持細(xì)胞內(nèi)鐵的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。細(xì)菌致病期間也需要鐵,尤其是細(xì)胞內(nèi)病原體,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明缺失鐵會(huì)嚴(yán)重降低結(jié)核分枝桿菌、熱柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌、鼠傷寒沙門菌及其他胞內(nèi)菌的致病性[13]。鐵蛋白由重鏈和輕鏈組成,Tsuji等[14-15]證實(shí)鐵蛋白重鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游有抗氧化反應(yīng)元件,該亞基具有亞鐵氧化酶作用,催化Fe2+氧化成 Fe3+,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,鐵蛋白重鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)抗氧化劑之一。所有的鐵蛋白都可以在有氧條件下與溶液中的二價(jià)鐵離子反應(yīng),鐵離子螯合在內(nèi)部的空心結(jié)構(gòu)中,抑制二價(jià)鐵離子氧化反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞不受鐵離子過量引起的氧化損害,而且亞鐵氧化中心能利用芬頓反應(yīng)的反應(yīng)物阻止自由基的產(chǎn)生,所以認(rèn)為鐵蛋白在抑制鐵離子的氧化損傷中具有重要作用[16]?；罨宿D(zhuǎn)錄因子NF-кB等,加速凋亡相關(guān)基因表達(dá)是氧化損傷引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一[17]。

本研究通過轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒干擾FTH1的表達(dá),通過實(shí)時(shí)定量檢測(cè)到16S rRNA的相對(duì)表達(dá)量降低約73%,Mkl1的相對(duì)表達(dá)量降低約76.3%,Birclb的相對(duì)表達(dá)量降低約88.8%。有資料顯示Mkl1、Birclb是細(xì)胞中的凋亡抑制因子[11],據(jù)此推測(cè):當(dāng)FTH1被干擾以后,Mkl1、Birclb的表達(dá)量隨之降低,那么細(xì)胞的凋亡速度就會(huì)相應(yīng)的增快,布魯氏菌造成的抑制巨噬細(xì)胞凋亡的程度也會(huì)相對(duì)的減弱。本研究可為以后研制抗布魯氏菌藥物提供理論參考。

[1]Delrue R M,Martinez-Lorenzo M,Lestrate P,et al.I-dentification of Brucella spp.genes involved in intracellular trafficking[J].Cell Microbiol,2001,3:487-497.

[2]尚德秋.中國(guó)布魯氏菌病防治科研50年[J].中華流行病學(xué)雜志,2000,21(1):55-57.

[3]張高軒,張銀國(guó).傳染性附睪炎公羊精液臨床病理學(xué)研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,5(1):48-50.

[4]唐利燕,陳創(chuàng)夫,王遠(yuǎn)志,等.布魯氏菌bp26基因的原核表達(dá)及Bp26間接 ELISA方法的初步建立[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,27(4):437-440.

[5]Carle A,H?ppner C,Ahmed Aly K,et al.The Brucella suis type IV secretion system assembles in the cell envelope of the heterologous host Agrobacterium tumefaciens and increases IncQ plasmid pLS1 recipient competence[J].Infect Immun.2006,74(1):108-117.

[6]Gross A,Terraza A,Ouahrani-Bettache S,et al.In vitro Brucella suis infection prevents the programmed cell death of human monocytic cells[J].Infect Immun,2000,68:342-351.

[7]王遠(yuǎn)志.綿羊種布魯氏菌致病的分子機(jī)制研究[D].石河子:石河子大學(xué),2008.

[8]Z M Qian,H Y Li,H Z Sun,et al.Targeted drug delivery via the transferring receptor-mediated endocytosis pathway[J].Pharmacol Rev,2002,54:561-587.

[9]陳斌.高原氧自由基代謝的研究進(jìn)展[J].高原醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(2):59-60.

[10]Jimenez de Bagues Maria-Pilar,Sherri Dudal,Jacques Dornand,et al.Cellular bioterrorism:how Brucella corrupts macrophage physiology to promote invasion and proliferation[J].Clin Immun,2005,114:227-238.

[11]He Y,Reichow S,Ramamoorthy S,et al.Brucella melitensis triggers time-dependent modulation of apoptosis and down-regulation of mitochondrion-associated gene expression in mouse macrophages[J].Infect Immun,2006,74(9):5035-5046.

[12]劉輝,陳創(chuàng)夫,許程劍,等.新疆綿羊種布魯氏菌 GroEL基因的克隆及序列分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,23(6):683-686.

[13]Braun V.Iron uptake mechanisms and their regulation in pathogenic bacteria[J].Int J Med Microbiol,2001,291(2):67-79.

[14]Tsuji Y,Moran E,Torti S V,et al.Transcriptional regulation of the mouse ferritin H gene.Involvement of p300/CBP adaptor proteins in FER-1 enhancer activity[J].J Biol Chen,1999,274(11):7501.

[15]Tsuji Y,Jun D.Activates transcription of the human ferritin H gene through an antiocidant response element during oxidative stress[J].Oncogene,2005,24(51):7567.

[16]劉寶娟,張文兵.鐵蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控[J].飼料工業(yè),2009,30(4):43.

[17]Can G Pham,Concetta Bubici,Francesca Zazzeroni,et al.Ferritin heavy chain upregulation by NF-B inhibits TNFα-induced apoptosis bysuppressing reactive oxygen species[J].Cell,2004,119(11):529-542.

Effect of Ferritin Heavy Chain 1 on the Expression of Apoptosis-Related Genes in Mouse RAW264.7 Macrophage Cells

DU Junwei1,2,WANG Yuanzhi2,CHEN Chuangfu2,GE Yangchun1,2
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi 832003,China)

S852.614;R378.5

A

1007-7383(2010)05-0565-04

2009-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(30800813),新疆兵團(tuán)博士基金(2009JC15),國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)項(xiàng)目(2010CB530200)

杜軍偉(1984-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樾笄莶≡肿由飳W(xué)。

王遠(yuǎn)志(1977-),男,副教授,從事免疫遺傳與抗病機(jī)制研究;e-mail:wyzshz@sina.com。