中國美利奴羊外周免疫器官cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定

李鑫,鄒毅輝,楊曉亮,李桂芳,李峰,陳芳,石國慶,高劍峰

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所,石河子832000)

中國美利奴羊外周免疫器官cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定

李鑫1,鄒毅輝1,楊曉亮1,李桂芳1,李峰1,陳芳1,石國慶2,高劍峰1

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所,石河子832000)

為了篩選中國美利奴羊與免疫反應(yīng)相關(guān)的的功能基因并研究這些基因的功能,構(gòu)建了以美利奴羊外周免疫器官的cDNA文庫。通過提取總RNA,分離純化mRNA并以其為模版參照ZAP Express cDNA Synthesis Kit說明書構(gòu)建cDNA文庫。結(jié)果表明:該文庫初級庫容達(dá)到了3.28×105pfu,擴(kuò)增庫滴度為3.8×108pfu/mL,重組率為97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之間,平均大小為1.5 kb。該文庫的成功構(gòu)建為后續(xù)研究奠定了分子基礎(chǔ)。

中國美利奴羊;外周免疫器官;cDNA文庫

Abstract:A cDNA library from peripheral immune organs of Merino sheep was constructed to screen genes related to Immunal Reaction and explore their functions.Total RNA were extracted from peripheral immune organs of Merino sheep and mRNA were purified to construct the cDNA library as template,according to the protocol of ZAP Express cDNA Synthesis Kit.Results showed that the cDNA library consisting of a primary contenet of 3.28×105pfu and on amplified tite of 3.8×108pfu/mL was constructed with the recombinant ratio of 97.7%.The average inserted fragments were about 1.5 kb with the majority ranging from 0.5 to 2.3 kb.It was concluded that the successfully constructed cDNA library has established a solid molecular basis for further study.

Key words:Chinese Merino sheep;peripheral immune organ;cDNA library

如何減輕牲畜傳染病對于綿羊養(yǎng)殖業(yè)所造成的損失,一直以來都是相關(guān)科研工作者研究的熱點(diǎn)。近年來各國學(xué)者將牲畜自身免疫系統(tǒng)在分子水平上抗病機(jī)理作為研究重點(diǎn),由于其可以提高牲畜自身免疫力,因此其已經(jīng)成為抗病育種、定向育種的一種重要手段[1]。不同品系綿羊抗病特性可能與其體內(nèi)某些與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因存在密切聯(lián)系,如果能夠通過分子生物學(xué)方法尋找并定位這些基因,就可以為綿羊的抗病育種提供科學(xué)依據(jù)[2-6]。

對于美利奴羊與免疫反應(yīng)相關(guān)基因(尤其是MHC基因)的研究方面已有報(bào)道。彭林澤等[3]應(yīng)用巢式PCR-RFLP方法,對211只中國美利奴(新疆軍墾型)羊的MHC-DRB1外顯子2的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測,并對基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明中國美利奴(新疆軍墾型)羊的MHC-DRB1基因外顯子2在 SacⅠ、HinlⅠ和 HaeⅢ的酶切位點(diǎn)存在多態(tài)性;申紅等[4]用PCR-RFLP方法對103只包蟲病(細(xì)粒棘球蚴病)陰性和101只陽性中國美利奴(新疆軍墾型)羊MHC-DQB1第2外顯子遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明中國美利奴(新疆軍墾型)羊的MHC-DQB1基因第2外顯子在MroxⅠ、ScaⅠ、SadⅠ、TaqⅠ、HaeⅢ和 MvaⅠ酶切位點(diǎn)存在豐富的多態(tài)性。中國科學(xué)院遺傳發(fā)育研究所與石河子大學(xué)利用細(xì)菌人工染色體載體pCC1BAC構(gòu)建了中國美利奴細(xì)毛羊(新疆軍墾型)的基因組BAC文庫[5]。文庫的克隆總數(shù)約為19萬個(gè),非重組率為3.2%,平均插入片段大小約為133 kb,約7.8倍基因組覆蓋率,連續(xù)多次傳代培養(yǎng)文庫實(shí)驗(yàn)證實(shí)文庫克隆的遺傳穩(wěn)定性好,為研究和篩選目的基因提供了良好的平臺。

cDNA文庫為眾多cDNA序列的集合,一個(gè)高質(zhì)量的文庫能包含大量基因資源和信息,這使得人們能方便快捷地篩選目的基因并對其進(jìn)行深入研究[7-13]。為了篩選綿羊體內(nèi)與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因,本研究利用中國美利奴羊(新疆軍墾型)的外周免疫組織,提取純化其 mRNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA,連接載體構(gòu)建文庫,并對其主要參數(shù)進(jìn)行檢測,以便對該文庫的質(zhì)量進(jìn)行評估。預(yù)期目標(biāo)為構(gòu)建一個(gè)擴(kuò)增庫滴度大于3.5×107pfu/mL,重組率大于95%,插入片段介于0.3至2.5 kb之間的中國美利奴羊外周免疫器官cDNA文庫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

在新疆石河子市西部牧業(yè)公司屠宰場及新疆農(nóng)墾科學(xué)院采集14只美利奴羊(新疆軍墾型)的脾臟及腸淋巴結(jié)共計(jì)140份。每份切成0.8～1 g不等,置于凍存管中液氮保存。

1.1.2 構(gòu)建文庫試劑盒及主要試劑

cDNA文庫構(gòu)建試劑盒ZAP Express cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Stratagene公司,mRNA分離純化試劑盒Oligotex mRNA Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品,DPEC及總 RNA提取試劑 TRIZOL購自Invitrogen公司。酵母提取物和胰蛋白胨(OXOID),卡那霉素、四環(huán)素(索萊寶公司),IPTG和 X-Gal(科百奧公司),RNase A(MBI)。MgSO4、瓊脂粉、瓊脂糖及低熔點(diǎn)瓊脂糖均購自Amresco公司,其余試劑為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及mRNA分離純化

稱取中國美利奴羊(新疆軍墾型)的脾臟及腸淋巴節(jié)組織塊共6 g混合,放入研缽加液氮研磨粉碎,稱取研磨混合物300 mg裝入50 mL離心管中6 mL TRIZOL分裝6個(gè)1.5 mL離心管,按照操作說明書提取總RNA,用體積百分比濃度為1%DPEC水溶解,取4.5μL溶液做甲醛變性電泳驗(yàn)證其完整性,取4μL稀釋并測定OD260和OD280吸光度值,定量計(jì)算RNA濃度。按照QIAGEN公司Oligotex mRNA Mini Kit操作說明書,從總RNA中分離純化mRNA。

1.2.2 cDNA雙鏈合成

以mRNA為模板,帶有 Xho I酶切位點(diǎn)的O1igod(T)為引物,在 AccuScript reverse transcriptase作用下轉(zhuǎn)錄出cDNA第1鏈。取2μL第1鏈產(chǎn)物電泳檢測。用RNaseH消化mRNA,然后以斷裂的mRNA作為第2鏈合成的引物,以cDNA第1鏈為模板,在DNA Polymerase I的作用下合成cDNA第2鏈。取2μL第2鏈產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.2.3 EcoR I/Xho I接頭連接及柱篩選

合成的cDNA在 T4DNA聚合酶作用下補(bǔ)平cDNA的末端,在其兩端連接 EcoR I接頭,經(jīng)過EcoR I末端磷酸化后進(jìn)行 Xho I酶切,并通過Sepharose CL-2B gel filtration medium去除400 bp以下的片段。

1.2.4 噬菌體包裝

從-80℃冰箱取出包裝提取物,用手溫浴包裝提取物使其快速融化,將連接好的cDNA快速加入到包裝提取物中,輕輕混勻上述混合物,低轉(zhuǎn)速離心3～5 s,室溫放置2 h。在混合物中加入500μL SM buffer和20μL氯仿并輕柔混勻,短暫離心以去除未與cDNA整合的提取物以及細(xì)胞碎片。

1.2.5 初級庫容計(jì)算

在2個(gè)直徑150 mm培養(yǎng)皿中分別鋪厚度約2 mm的NZY固體培養(yǎng)基,并均勻涂抹 X-Gal(250 mg/mL)及 IPTG(0.5 mol/L),XL1-Blue MRF′菌株單菌落在補(bǔ)充培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜培養(yǎng);離心去上清,菌體用10 mmol/L硫酸鎂稀釋吸打混勻至OD600=0.5,取原庫 2μL與 400μL XL1-Blue(OD600=0.5)菌液吸打混勻,37℃加熱15 min后與8 mL的NZY頂層培養(yǎng)基混合均勻,上述混合物按每板201μL在制備好的NZY瓊脂培養(yǎng)基平板上鋪展,待NZY頂層培養(yǎng)基溫度降至室溫后,37℃培養(yǎng)6 h后計(jì)數(shù)每板噬菌斑數(shù)量。

1.2.6 文庫擴(kuò)增與滴度計(jì)算

在37個(gè)直徑150 mm培養(yǎng)皿中分別鋪厚度約2 mm的NZY固體培養(yǎng)基,挑取 XL1-Blue MRF′菌株單菌落在補(bǔ)充培養(yǎng)基中振蕩,過夜培養(yǎng);離心去上清,菌體用 10 mmol/L硫酸鎂稀釋吸打混勻至OD600=0.5,按照每5×104個(gè)噬菌斑與600μL稀釋好的XL1-Blue MRF′菌液混合均勻。37℃溫浴15 min后,與6.5 mL的NZY頂層固體培養(yǎng)基混合均勻,在一個(gè)培養(yǎng)皿的NZY固體培養(yǎng)基表面均勻鋪滿,37℃培養(yǎng)6～8 h,每個(gè)培養(yǎng)皿中加入8 mL SM buffer。4 ℃放置過夜,將所有 SM buffer倒入一個(gè)塑料收集瓶中,每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 mL的SM buffer洗滌,加入氯仿至終體積 5%,充分混勻,4000r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片,將上清液收集到一個(gè)新的收集瓶中,加入DMSO至體積終濃度8%,-80 ℃保存,將擴(kuò)增文庫按照 1∶500、1∶1000、1∶5000、1∶10000的體積稀釋比例用 SM緩沖液進(jìn)行稀釋,即每1μL擴(kuò)增庫分別被稀釋至5001μL,1 mL,5 mL,10 mL四個(gè)稀釋梯度分別取稀釋液1μL與600μL OD600=0.6的 XL1-Blue菌液吸打混勻,37℃加熱15 min后,與8 mL的NZY頂層培養(yǎng)基混合均勻,每個(gè)梯度鋪三板,在制備好的NZY瓊脂培養(yǎng)基平板上鋪展,待NZY頂層培養(yǎng)基溫度降至室溫后,37℃培養(yǎng)6 h后計(jì)數(shù)每板噬菌斑數(shù)量。

1.2.7 pBK-CMV載體大量剪切

為了獲得并分析插入片段相關(guān)信息以便對cDNA文庫質(zhì)量進(jìn)行評價(jià),按照試劑盒操作手冊的說明,借助輔助噬菌體將pBK-CMV載體從ZAP Express載體上剪切下來,轉(zhuǎn)染 XLOLR菌株提取質(zhì)粒,通過 EcoR I/Xho I雙酶切從pBK-CMV嗜菌粒切下雙鏈cDNA進(jìn)行電泳驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA濃度計(jì)算及質(zhì)量鑒定

濃度測定:取4μL總 R NA溶液,加996μL 1%DEPC處理的無菌水于紫外分光光度儀中檢測吸光度 ,讀 數(shù) O D260=0.434,濃度為 4 .34μg/μL,OD280=0.247,A260nm/A280nm=1.757?？俁NA溶液中取4 μL在膠濃度1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行甲醛變性電泳,電壓5 V/cm,時(shí)間15 min,經(jīng)過凝膠成像后出現(xiàn)28 S、18 S、5.8 S三條帶,其中28 S與18 S兩條帶亮度比值約為2∶1,5.8 S帶亮度較低,總RNA各條帶未見明顯降解,符合建庫要求(圖1)。

2.2 cDNA第1、2鏈的質(zhì)量鑒定

cDNA的第1、2鏈產(chǎn)物各取2μL。以膠質(zhì)量百分比濃度0.9%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。電壓5 V/cm,電泳20 min,電泳結(jié)果表明雙鏈產(chǎn)物彌散帶跨度較大,表明所合成的cDNA分子量較分散,范圍為400～3000 bp,帶型為連續(xù)彌散帶,符合建庫要求(圖2)。

圖1 美利奴羊總RNA電泳分析Fig.1 Analysis of total RNA of Merino sheep

圖2 cDNA第一條鏈和第二條鏈電泳Fig.2 Analysis of cDNA of Merino sheep

2.3 cDNA文庫的初級庫庫容量和擴(kuò)增庫滴度的計(jì)算

2.3.1 初級庫庫容量計(jì)算

初級庫共得到3120μL噬菌體溶液,從每個(gè)直徑150 mm含NZY固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿取1μL噬菌體溶液鋪板,平均噬菌體數(shù)量為每板105個(gè)克隆,計(jì)算得到的初級庫庫容量為3.28×105pfu。

2.3.2 擴(kuò)增庫滴度的計(jì)算

按照1.2.6實(shí)驗(yàn)方法推算擴(kuò)增庫的平均滴度,約為3.8×108pfu/mL。

2.4 cDNA文庫重組率計(jì)算及插入片段大小分析

在經(jīng)過多克隆剪切后的平板上隨機(jī)挑取的個(gè)白色重組子進(jìn)行酶切后電泳驗(yàn)證,共挑取克隆63個(gè),有1個(gè)酶切產(chǎn)物未見插入片段,文庫的重組率為97.7%,cDNA文庫平均插入片段的計(jì)算:隨機(jī)挑取26個(gè)克隆,上述且大多數(shù)插入的片段為0.5～2.3 kb,平均插入片段約 1.5 kb(圖 3、4)。

圖3 部分隨機(jī)克隆酶切圖譜Fig.3 Inserts size estimation of recombinants by digestion

圖4 部分隨機(jī)克隆酶切圖譜Fig.4 Inserts size estimation of recombinants by digestion

3 討論

cDNA文庫篩選是獲取基因全長cDNA的基本方法之一?；蛉LcDNA的獲取是研究酶結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控、基因工程應(yīng)用的重要前提。cDNA來源于細(xì)胞的mRNA,便于克隆和大量擴(kuò)增,可從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因,并直接用于目的基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因研究。近年來,隨著cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)的日益成熟和普及,該技術(shù)已經(jīng)成為各實(shí)驗(yàn)室克隆相關(guān)性狀基因的一種首選方法[8]。

在構(gòu)建cDNA文庫的過程中,目的片段與載體連接之前,cDNA小片段的刪除效率的高低直接影響初始文庫滴度。如果短片段不能被有效篩除,那么其將會與載體優(yōu)先連接,降低文庫平均插入片段長度,使文庫質(zhì)量降低。但如果為保證文庫的平均插入片段長度而篩除過多的cDNA片段,則會造成文庫的初始滴度下降,從而造成基因丟失,降低了文庫的覆蓋率[9]。本實(shí)驗(yàn)在cDNA與載體連接之前,將合成的cDNA通過Sepharose CL-2B柱,分級分離cDNA可有效去除小片段。

本研究中所選用的Stretagene公司試劑盒在cDNA第2鏈合成的方法上選用置換合成法而非PCR擴(kuò)增法,其優(yōu)點(diǎn)是避免了在PCR過程中因擴(kuò)增效率不同而導(dǎo)致的mRNA合成cDNA效率的變化,這種方法對于獲得一些較低拷貝數(shù)基因的克隆具有促進(jìn)作用,也是我們選擇該方法的主要原因。其缺點(diǎn)是部分降解的mRNA會使所構(gòu)建文庫中全長cNDA的比例下降,而且所需初始mRNA的量較大[9]。

本研究中構(gòu)建文庫使用的λZAP Express載體既可在真核系統(tǒng)中表達(dá),又可在原核系統(tǒng)中表達(dá),共有12個(gè)克隆位點(diǎn),適合小于12 kb cDNA插入片段,而且插入片段以卡那霉素抗性的pBK-CMV噬菌粒載體的形式從噬菌體載體上切下,這個(gè)質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有 T7噬菌體和 T3噬菌體啟動子,這有利于DNA序列分析及融合蛋白的表達(dá),用此載體構(gòu)建的cDNA文庫既可用DNA探針又可用抗體探針篩選,而且便于對篩選到的陽性克隆進(jìn)行測序和表達(dá)[9]。

為了快速高效篩選免疫反應(yīng)相關(guān)的基因以便對其進(jìn)行深入研究,我們構(gòu)建了中國美利奴羊(新疆軍墾型)外周免疫器官混合cDNA文庫,質(zhì)量評價(jià)結(jié)果表明:初級庫容達(dá)到3.28×105pfu,擴(kuò)增庫滴度為3.8×108pfu/mL,重組率為97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之間,平均大小為1.5 kb。本研究結(jié)果表明:該文庫的各項(xiàng)參數(shù)均達(dá)到了預(yù)期指標(biāo)且質(zhì)量較高。這為快速高效篩選中國美利奴羊(新疆軍墾型)體內(nèi)與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因奠定了分子基礎(chǔ)。這些基因可能與不同品系綿羊抗病特性、生產(chǎn)性能或者經(jīng)濟(jì)性狀存在密切相關(guān)。如果能夠通過分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行尋找并定位,就可以為綿羊的抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

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Construction and Characterization of cDNA Library from Peripheral Immune Organ of Merino Sheep

LI Xin1,ZOU Yihui1,YANG Xiaoliang1,LI Guifang1,LI Feng1,CHEN Fang1,SHI Guoqing2,GAO Jianfeng1
(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation,Shihezi 832000,China)

S827.2;Q959.842

A

1007-7383(2010)05-0529-05

2009-04-16

科技部重大國際合作項(xiàng)目(2006DFB33750)

李鑫(1983-),男,碩士,研究方向?yàn)閯游锩庖吲c育種;e-mail:lxin@shzu.edu.cn。

高劍峰(1964-),男,教授,從事動物免疫與育種研究;e-mail:jianfengg@shzu.edu.cn。