IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多態(tài)性與新疆哈薩克族代謝綜合征及其組分的相關(guān)性研究

芮素芳,郭淑霞,唐景霞,張翼華,張景玉,郭恒,楊志明

(新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多態(tài)性與新疆哈薩克族代謝綜合征及其
組分的相關(guān)性研究

芮素芳,郭淑霞,唐景霞,張翼華,張景玉,郭恒,楊志明

(新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

為探討IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多態(tài)性與新疆哈薩克族代謝綜合征(MS)及其組分的相關(guān)性。應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)新疆哈薩克族MS病例組200例及對(duì)照組201例的白細(xì)胞介素6基因-174G/C位點(diǎn)及CRP基因+1059G/C位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。IL-6-174G/C位點(diǎn)MS組與對(duì)照組均以GG基因型為主,其頻率分別為94%和98.5%,GC基因型頻率分別為6.0%和1.5%,CC型在MS組有1例,占0.5%,在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)。G和C等位基因頻率在MS組分別為97.0%和3.0%,兩組基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.66,P<0.05)兩組間等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.43,P<0.05);CRP+1059G/C位點(diǎn)MS組與對(duì)照組以 GG基因型為主,其頻率分別為93.0%和99.0%,GC基因型頻率在兩組分別為7.0%和1.0%,CC純合子基因型在兩組中均未檢出。G和C等位基因頻率在MS組分別為96.5%和3.5%,兩組基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.43,P<0.05),兩組等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.24,P<0.05)。IL-6-174G/C和CRP+1059G/C基因多態(tài)性與哈薩克族代謝綜合征及組分有一定關(guān)聯(lián)。

IL-6-174G/C;CRP+1059G/C;哈薩克族;代謝綜合征;基因多態(tài)性

Abstract:To study the associations of the gene polymorphism at-174G/C interleukin-6 and C-reactive protein(CRP)+1059 G/C in patients with metabolic syndrome and its components of the Xinjiang Kazakh population.We used PCR-RFLP to detect the frequency of IL-6-174G/C and CRP+1059G/C genotype and alleles in Xinjiang Kazakh residents of Shawan and the Bortala region over 18 years old.The IL-6-174G/C gene frequency of GG in the MS group was 94.0%,GC was 6.0%,CC was 0.5%and the allele gene frequency of G and C was 97.0%and 3.0%,there was statistically significant difference in these gene distributions among MS group and normal group(χ2=5.66,P<0.05),The CRP gene frequency of GG in MS group was 93.0%,GC was 7.0%CC was not found between the two groups,and the allele gene frequencyof Gand C was 96.5%and 3.5%.There were statistically significant differences in these gene distributions among MS group and normal group(χ2=9.43,P<0.05).These results suggest that the interleukin-6 gene-174G/C and CRP+1059G/C polymorphism was associated with metabolic syndrome and its components of xinjiang Kazakh population.

Key words:Kazakh;IL-6-174G/C;CRP+1059G/C;metabolic syndrome

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS),是以胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ),以中心性肥胖、高血壓、糖代謝及脂代謝異常、高胰島素血癥、高尿酸血癥和炎性標(biāo)志物水平增高等為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。近年來(lái)研究已證實(shí)炎癥因子白細(xì)胞介素(IL-6)及C反應(yīng)蛋白(CRP)與MS的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)新疆哈薩克族高血壓、糖尿病標(biāo)化患病率、空腹血糖損害檢出率、超重、肥胖比例均明顯高于全國(guó)的水平,新疆哈薩克族MS的患病率為26.7%[3],但確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)哈薩克族MS的遺傳易感性。本研究運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism PCR-RFLP)方法檢測(cè)新疆哈薩克族人群 IL-6-174G/C和CRP+1059G/C基因多態(tài)性,探討其與MS及其組分的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

采用分層整群抽樣的方法抽取1444名新疆博樂(lè)地區(qū)和沙灣縣18歲及以上哈薩克族居民進(jìn)行MS現(xiàn)況調(diào)查,在此基礎(chǔ)上參照2005年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)對(duì)MS的定義[4],隨機(jī)抽取200例MS患者作為病例組,并從同一人群按成組匹配方法隨機(jī)抽取非MS者201例作為對(duì)照組。

1.2 研究指標(biāo)

采用調(diào)查表對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,內(nèi)容包括人口學(xué)資料、個(gè)人疾病史、心腦血管病家族史、吸煙和飲酒史、膳食、運(yùn)動(dòng)情況等,并采用標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范的方法測(cè)量研究對(duì)象的血壓、身高、體重、腰圍、臀圍等。實(shí)驗(yàn)室檢查包括:血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和空腹血糖(FPG)等,以上測(cè)定在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取

取研究對(duì)象空腹靜脈血200μL,采用經(jīng)典酚-氯仿法提取血液基因組DNA,并用電泳檢測(cè)抽提結(jié)果,完成后放入-80℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增

IL-6-174G/C位點(diǎn)引物序列參照文獻(xiàn)[5],上游5′TGACTTCAG CTTTACTCTTGT 3′,下游 5′CTGATTGGAAACCTTATTAAG3′;CRP+1059G/C位點(diǎn)引物序列[6],上游5′GATCTGTGTGTGATCTGAGAAACCTCT 3′,下游 5′GAGGTACCAGAGACAGAGACGTG 3′,(引物由大連寶生物公司合成),兩位點(diǎn) PCR反應(yīng)體系相同均為25μL,其中模板 DNA 為 1.9μL、Buffer 2.5μL、dNTP 2μL、Taq DNA 聚合酶((含 Mg2+,2.5 U/μL))0.6μL、上游和下游引物各為1μL 、ddH2O 16μL(所有試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品)PCR反應(yīng)條件:IL-6-174G/C位點(diǎn):94℃預(yù)變性5 min,按循環(huán)程序94℃變性45 s,56℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min共循環(huán)35次,再進(jìn)行72℃終末延伸10 min,結(jié)束后-20℃保存;CRP+1059G/C位點(diǎn):94℃預(yù)變性5 min,按循環(huán)程序94℃變性45 s,65℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min共循環(huán)35次,再進(jìn)行72℃終末延伸10 min,結(jié)束后-20℃保存。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的消化及電泳

1.3.3.1 IL-6-174G/C位點(diǎn) 用NlaⅢ內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB公司)酶切,反應(yīng)體系為20μL,其中 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL,10×BSA 緩沖液0.2μL、Buffer 2 μL、NlaⅢ內(nèi)切酶0.2μL、ddH2O 7.6μL 37 ℃水浴2 h,用3%瓊脂糖凝膠電泳1 h,在Bio-Rad凝膠成像儀上觀察酶切結(jié)果(圖1)。

圖1 I L-6-174G/C酶切位點(diǎn)的PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The PCR-RFLP detection result of I L-6-174G/C by NLAⅢendonuclease

IL-6-174G/C擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為198 bp,GG型出現(xiàn)2個(gè)片段167 bp、31 bp(片段太小不能顯示);GC型出現(xiàn)4個(gè)片段167 bp、122 bp、45 bp和31 bp(片段太小均不能顯示);CC型(122 bp、45 bp、31 bp);從左向右依次為 Marker、PCR產(chǎn)物、GG型(167 bp、31 bp)、CC 型(122 bp、45 bp、31 bp)、GC型(167 bp、122 bp、45 bp 和 31 bp,其中45 bp 和 31 bp片段太小,均不能顯示出來(lái))。1.3.3.2 CRP+1059G/C位點(diǎn) 用MaeⅢ內(nèi)切酶(Roche Diagnostics,Germany)酶切,反應(yīng)體系為20 μL,其中 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 10μL,Buffer 12.5μL、NlaⅢ內(nèi)切酶 0.5μL、ddH2O 7.6μL 55 ℃水浴 1 h,2%瓊脂糖凝膠電泳1 h,Golden view染色后,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照,酶切結(jié)果(圖2)表明:CRP+1059G/C擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為744bp,GG型出現(xiàn)310 bp、233 bp、201 bp 3個(gè)片段,GC型出現(xiàn)434 bp、310 bp、233 bp 和 201 bp 4個(gè)片段 ,從左向右依次為 Marker、PCR產(chǎn)物、GC型(434 bp、310 bp、233 bp、201 bp)、GG型(310 bp、233 bp、201 bp)及 GC型(434 bp、310 bp、233 bp、201 bp)。

圖2 IL-6-174G/C酶切位點(diǎn)的PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The PCR-RFLP detection result of CRP+1059G/C by MaeⅢendonuclease

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 Epidata3.02軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因的基因表型頻率,組間等位基因表型頻率的比較用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,計(jì)算比值比(Odds ratio,OR)估計(jì)相對(duì)危險(xiǎn)度,并計(jì)算OR值95%的可信區(qū)間(confidence interval,CI)。

2 結(jié)果

2.1 MS組與對(duì)照組一般情況

見(jiàn)表1。MS病例組中男性112例,女性88例,其平均年齡(50.07±11.56)歲;對(duì)照組中男性121例,女性80例,平均年齡(48.23±12)歲。兩組年齡均衡(t=1.56,P=0.12)、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.726,P>0.05),兩組基因型經(jīng)檢驗(yàn)分布符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.275,P>0.05),具有群體代表性,可以代表哈薩克族人群。兩組間的腰圍、臀圍、WHR 、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、SBP、DBP、BMI的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明MS各組分在兩組之間有差別。

表1 MS組與正常對(duì)照組一般情況比較Tab.1 Comparison of MS group and Control yroup Clinical Characteristies

2.2 MS組與對(duì)照組 IL-6啟動(dòng)子-174位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較見(jiàn)表2。

表2 MS組與對(duì)照組IL-6啟動(dòng)子-174位點(diǎn)基因型和等位基因頻率Tab.2 Genotypes and alleles of the IL-6-174G/C betweea MS and Gontrol group

由于兩組中有1例CC型,將其合并入 GC組中,所以 GG型和 GC+CC型基因頻率分別為96%和3.7%,MS組與對(duì)照組頻率分別為94%和98.5%,GC基因型頻率在兩組分別為6.0%和1.5%,G和C等位基因頻率分別為96.8%和3.3%;兩組間基因型的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.66,P<0.05),兩組間等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.43,P<0.05)。以 G等位基因?yàn)閰⒄?C等位基因的OR為4.12(95%CI:1.38～12.29),這表明攜帶C等位基因者患MS的危險(xiǎn)性是攜帶 G等位基因的4.12倍。

2.3 MS組與對(duì)照組CRP+1059位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較

見(jiàn)表3。兩組均以 GG型為主,其頻率分別為93%和99%,兩組 GC基因型頻率分別為7.0%和1.0%,CC型純合子基因型在兩組中均未檢出。兩組基因型的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.43,P<0.05),兩組等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.24,P<0.05)以 G等位基因?yàn)閰⒄?C等位基因的OR值為7.25(95%CI:2.04～25.76),這表明攜帶C等位基因者患MS的危險(xiǎn)性是攜帶G等位基因的7.25倍。

表3 MS組與對(duì)照組CRP+1059位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較Tab.3 Genotypes and Alleles of the CRP+1059G/C between MS and Control group

2.4 IL-6啟動(dòng)子-174位點(diǎn)基因型與MS的關(guān)系

見(jiàn)表4。IL-6-174位點(diǎn) GG基因型與 GC基因型在 TG、HDL-C、LDL-C、FPG上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而在腰圍、臀圍、WHR、TC、SBP、DBP及BMI上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 IL-6啟動(dòng)子-174位點(diǎn)基因型與MS各組分的關(guān)系Tab.4 Association of IL-6-174G/C genotype and Metabolic Syndrome and its Components

2.5 CRP+1059位點(diǎn)基因型與MS的關(guān)系

見(jiàn)表5。由表5可知,CRP+1059位點(diǎn) GG型和 GC型在腰圍、臀圍、HDL-C、FPG、DBP和BMI上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 CRP+1059位點(diǎn)基因型與MS各組分的關(guān)系Tab.5 Association of CRP+1059G/C genotype and Metabolic Syndrome and its Components

3 討論

人類IL-6基因位于第7號(hào)染色體短臂上,含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,IL-6基因有許多單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及5′側(cè)翼區(qū)域及3′側(cè)翼區(qū)域數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)等多態(tài)性。有研究表明[7],IL-6基因啟動(dòng)子上游第180bp至第123bp區(qū)域是IL-6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵區(qū)域。在IL-6基因啟動(dòng)子上游第174位點(diǎn)存在G/C單核苷酸替換多態(tài)性,其等位基因多態(tài)性可影響IL-6基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)而影響IL-6與一些相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)IL-6-174位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠心病、心肌梗塞、2型糖尿病[8]及胰島素抵抗[9]等易感性和臨床表現(xiàn)有關(guān)聯(lián)。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)IL-6基因-174G/C多態(tài)性存在與歐美人種完全不同的頻率分布特征及代謝特征,IL-6-174位點(diǎn)基因型和基因頻率分布基本相似但個(gè)別略有差異。楊翼衡[10]等研究IL-6基因174G/C多態(tài)性與胰島素抵抗的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群IL-6-174基因位點(diǎn)幾乎均為GG基因型,明顯不同于歐美人群,C等位基因僅占1.4%,為稀有堿基。本研究發(fā)現(xiàn)哈薩克族人群IL-6-174基因位點(diǎn)也以 GG基因型為主,其頻率為96.3%,在MS組中發(fā)現(xiàn)1例突變純合子CC型,等位基因C的頻率(3.0%)與天津市漢族人(3.6%)較為接近,卻明顯低于歐美人群(20%～40%),提示IL-6-174位點(diǎn)分布有種族的差異,這種種族間的遺傳背景差異有可能招致同一種突變?cè)诓煌巳寒a(chǎn)生不同的表型效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)哈薩克族MS組 GC基因型發(fā)生MS的危險(xiǎn)性是對(duì)照組GG基因型的4.21倍,以G等位基因?yàn)閰⒄?C等位基因的OR為4.12(95%CI:1.38～12.29),說(shuō)明攜帶C等位基因者患MS的危險(xiǎn)性是攜帶G等位基因的4.12倍。GG基因型與GC基因型在腰圍、臀圍、腰臀比、TC、SBP、DBP 及BMI上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)提示哈薩克族IL-6-174G/C位點(diǎn)基因多態(tài)性MS及組分有一定相關(guān)性。

近年來(lái)研究顯示,CRP與MS及其各組分的關(guān)系非常密切,胡傲容等[11]研究證實(shí)代謝綜合征與炎癥密切相關(guān),隨著MS組分?jǐn)?shù)目增加,hsCRP水平逐漸增高,提示CRP可作為代謝綜合征的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。國(guó)外學(xué)者Vicker[12]發(fā)現(xiàn)遺傳因素影響個(gè)體CRP基礎(chǔ)水平,1059位點(diǎn) G等位基因與C等位基因攜帶者血清CRP基礎(chǔ)水平存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)1059位點(diǎn) GG型和 GC型在腰圍、臀圍、HDL-C、FPG、DBP和 BMI上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以 G等位基因?yàn)閰⒄?C等位基因的OR值為7.25(95%CI:2.04～25.76),說(shuō)明攜帶C等位基因者患MS的危險(xiǎn)性是攜帶 G等位基因的7.25倍。聶海等[13]研究CRP與代謝綜合征組分及靶器官損害的關(guān)系發(fā)現(xiàn),基因多態(tài)性與MS組分中的收縮壓、腹圍、FPG相關(guān),GC基因型與腹圍、收縮壓、FPG等有關(guān)。本研究結(jié)果認(rèn)為CRP+1059位點(diǎn)GG型與 GC型在腰圍、臀圍、HDL-C、FPG、DBP和BMI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本研究結(jié)果顯示IL-6-174G/C及CRP+1059G/C基因多態(tài)性與哈薩克族MS及其組分有一定相關(guān)性,尤其是與血壓、腰圍、臀圍、BMI的關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,新疆哈薩克族人群中高血壓、高血糖、高血脂及肥胖等健康問(wèn)題較為突出,因此,及早發(fā)現(xiàn)并有效控制哈薩克族人群的血壓和腰圍水平顯得尤為重要。

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Association of Interleukin-6 Promoter-174G/C and C-reactive Protein+1059 G/C Polymorphisms with Metabolic Syndrome and its Components in the K azakhs of Xinjiang

RUI Sufang,GUO Shuxia,TANGJingxia,ZHANG Yihua,ZHANGJingyu,GUO Heng,YANG Zhiming
(Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi University,Shihezi 832002,China)

R181.38

A

1007-7383(2010)04-0469-05

2009-01-05

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2009BAI82B04),新疆兵團(tuán)國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2009YD33)

芮素芳(1979-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)槁圆×餍胁W(xué)。

郭淑霞(1962-),女,教授,從事慢性病流行病學(xué)的研究;e-mail:pge888@sina.com。