新疆牦牛多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥物敏感實驗

康立超,田亮,張曉宇,王平福,薄新文,馬勛

(1新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室,石河子832000;2石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子832003;3新疆兵團(tuán)農(nóng)十二師104團(tuán),烏魯木齊 830009)

新疆牦牛多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥物敏感實驗

康立超1,田亮2,張曉宇2,王平福3,薄新文1,馬勛2

(1新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室,石河子832000;2石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子832003;3新疆兵團(tuán)農(nóng)十二師104團(tuán),烏魯木齊 830009)

為確診新疆某牦牛場的某疾病的發(fā)病病源,控制病情蔓延,對該病病原進(jìn)行分離培養(yǎng)、小白鼠致病性試驗、生化鑒定、PCR鑒定。結(jié)果表明:得到6株多殺性巴氏桿菌;這6株分離菌均對慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺、土霉素等藥物敏感;根據(jù)多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因擴(kuò)增了1條457 bp的特異性條帶,對其進(jìn)行測序分析,結(jié)果表明其與 GenBank提交的12條多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因序列同源性達(dá)97%～99%。

牦牛;多殺性巴氏桿菌;分離鑒定;藥敏試驗

Abstract:In order to determine the pathogen and control outbreak the pestilence in some farm of Yak in Xinjiang,fractional cultivation of pathogen,pathogenicity test of mice,identification of biochemistry and physiology and PCR were done.The result indicated that 6 strainsPasteurellosis multocidawere obtained;the 6 strains were sensitive to cidomycin,tetracycline,streptomycin,sulfasulfonamides,oxytetracycline etc.The PCR products were 457 bp and specificity bands ofKM T-1 gene ofPasteurellosis multocida.The homology ofKM T-1 gene was 97%～99%with other ofKM T-1 gene ofPasteurellosis multocidain GenBank.

Key words:yak;Pasteurellosis multocida;isolation identification;sensitive test of drug

巴氏桿菌病(Pasteurellosis)主要是由特定血清型的多殺性巴氏桿菌(Pasteurellosis multocida,Pm)引起畜禽共患的一種烈性傳染病。其主要有多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌和嗜肺性巴氏桿菌等引起,其中以多殺性巴氏桿菌存在較為普遍,能夠引起豬肺疫、牛出血性敗血癥、禽霍亂等多種臨床疾病[1]。多殺巴氏桿菌菌體抗原有12個型,莢膜抗原有5個型,血清型眾多(16種血清型),在毒力及流行病學(xué)等方面的生物學(xué)特性差異很大。血清型與宿主的分布有一定關(guān)系[2]。其細(xì)胞壁含有明顯的內(nèi)毒素活性,但未發(fā)現(xiàn)外毒素。巴氏桿菌病呈世界性分布,各種畜、禽乃至野生動物均可發(fā)病[3]。

我國先后從11種畜禽的自然病例中共分離出多殺性巴氏桿菌25株,大致可分成Fg和Fo 2個菌株類型。牛、豬、驢和馬的該病絕大多數(shù)為Fg型菌所致,家禽流行性巴氏桿菌病均由Fo型菌所致[4]。

近2年新疆某牦牛場出現(xiàn)犢牛死亡。其臨床癥狀表現(xiàn)為病初體溫高達(dá)41～42℃,精神沉郁,呼吸加快,有痛苦性干咳,下痢,氣味惡臭。病理變化表現(xiàn)為肺臟表面有肝變區(qū),呈大理石樣花紋,有纖維素性胸膜炎變化,有化膿灶;肝腫脹;淋巴結(jié)明顯水腫出血;個別牛膝關(guān)節(jié)腫大,發(fā)炎化膿。為了確定其病原,本實驗對其進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

無菌采取4頭瀕死犢牛心血、肺、肝、關(guān)節(jié)液。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通瓊脂平板、5%兔或羊鮮血瓊脂平板、麥康凱平板、LB肉湯,常規(guī)生化鑒定培養(yǎng)基[5]等。

1.1.3 菌株

感受態(tài)大腸桿菌JM109由新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室保存;多殺性巴氏桿菌(CVCC393)購于中監(jiān)所;大腸桿菌(ATCC25922)、白色念珠菌(ATCC2002)、鏈球菌(ATCC55121)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的昆明動物研究所饋贈。

1.1.4 實驗動物

健康昆明系小白鼠32只(16～18 g)。

1.1.5 藥敏紙片

參考杭州天和微生物試劑有限公司的紙片濁藥敏試驗抑制直徑料斷標(biāo)準(zhǔn)。青霉素鉀(10μg/片),四環(huán)素(30μg/片),氧氟沙星(5μg/片),慶大霉素(10μg/片),氟苯尼考(30μg/片),諾氟沙星(10 μg/片),阿莫西林(20μg/片),土霉素(30μg/片),氨芐西林(10μg/片),鏈霉素(10μg/片),磺胺(10 μg/片),卡那霉素(30μg/片)。

1.1.6 主要試劑

pUCm-T vector試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生物工程有限公司。MarkerⅠ、Taq DNA聚合酶和dNTP購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

病料觸片,進(jìn)行瑞特氏染色、鏡檢。將病料分別無菌接種到LB肉湯、普通瓊脂平板、5%兔或羊鮮血瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18～24 h,進(jìn)行細(xì)菌的分離純化培養(yǎng),純培養(yǎng)物革蘭氏染色。

1.2.2 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)物無菌接種于常規(guī)生化鑒定培養(yǎng)基(葡萄糖、靛基質(zhì)、甘露醇、麥芽糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、果糖、MR、VP、檸檬酸、尿素、H2S、硝酸鹽、觸酶)中,37℃培養(yǎng)48 h,判斷結(jié)果。

1.2.3 動物試驗

將6株臨床分離菌的純培養(yǎng)物制成菌懸液,每株菌腹腔注射 3只小白鼠(0.2 mL/只,3×109CFU/mL),2只腹腔注射LB肉湯做陰性對照。

1.2.4 藥敏試驗

將純化好的細(xì)菌用滅菌生理鹽水洗下,并且與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?選取3×109CFU/mL濃度的菌懸液,用滅菌棉拭子均勻涂布鮮血瓊脂平板,分別貼上各種藥敏紙片,37℃培養(yǎng)24 h判定結(jié)果,判定標(biāo)準(zhǔn)參照參考杭州天和微生物試劑有限公司紙片法藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 PCR鑒定

1.2.5.1 引物合成

根據(jù)多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因(GenBank登錄號:AF016259)由上海生物工程有限公司合成引物。上游引物PM1:ATCCGCTATTTACCCAGTGG,下游引物PM2:GCTGTAAACGAACTCGCCAC[6]。

1.2.5.2 PCR模板、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件

采用堿裂解法提取各個細(xì)菌基因組[7]。PCR反應(yīng)體系(25μL):10×Buffer 2.5μL,25 mmol/L MgCl21μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板1μL,無菌水16μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃變性3 min;然后進(jìn)入30個循環(huán),94 ℃30 s、59 ℃30 s、72℃40 s;最后72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物4℃短時保存。

1.2.5.3 PCR結(jié)果觀察

取PCR擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物3μL,加到含 EB的0.8%瓊脂糖膠中,在100 V電壓下電泳30 min,然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.6 KMT-1基因的克隆

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收,回收產(chǎn)物與pUCm-T vector連接,10μL連接體系:10×Ligation Buffer 1μL,pUCm-T vector 1μL,50%PEG4000 1μL,ddH2O 1μL,T4DNA Ligase 1μL,PCR 純化產(chǎn)物 5μL,16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,挑選在含有Amp的LB-瓊脂平板上生長的菌落,采用菌落PCR法進(jìn)行陽性菌落的鑒定。

1.2.7 KMT-1基因的測序及序列分析

挑取陽性菌落在含有Amp的LB肉湯中培養(yǎng)后送往上海生物工程有限公司測序部對pUCm-T vector中的插入片段進(jìn)行測序。用DNAMAN分析序列并與其他菌株進(jìn)行同源比較。

2 結(jié)果

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特性

從發(fā)病犢牛組織中分離到6株細(xì)菌,菌株編號為B1～B6;心血、肝、肺等病料觸片,瑞特氏染色鏡檢,觀察到兩極濃染的小桿菌(圖1)。6株菌純培養(yǎng)物革蘭氏染色為革蘭氏陰性小桿菌。在LB肉湯培養(yǎng)24h后渾濁,連續(xù)培養(yǎng)2～3 d,液體清徹,管底有粘稠液體;在普通瓊脂平板上生長貧瘠;在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色、圓形、微隆起、半透明、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的露珠樣菌落;在麥康凱不生長;在兔或羊鮮血瓊脂平板上均不溶血(圖2)。

圖1 肝抹片(瑞特氏,100ⅹ10)Fig.1 Smear of liver(wright’s 100ⅹ10)

圖2 鮮血瓊脂平板Fig.2 Agar plate of blood

2.2 生化鑒定結(jié)果

從表1可以看出,B1～B6與標(biāo)準(zhǔn)菌株生化鑒定結(jié)果基本一致,疑似為多殺性巴氏桿菌。

表1 分離株生化試驗結(jié)果Tab.1 The result of biochemistry to experiment

2.3 動物試驗結(jié)果

臨床分離株均有強(qiáng)致病性,攻毒小白鼠24～48h全部死亡。從死亡小鼠心血,肝中分離到革蘭氏陰性小桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司紙片法藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn),分離菌對慶大霉素(φ=24 mm)、四環(huán)素(φ=20 mm)、鏈霉素(φ=20 mm)、磺胺(φ=28 mm)、土霉素(φ=34 mm)等藥物敏感,對其他藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性,尤其是卡那霉素(φ=6 mm)。

2.5 PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

預(yù)計擴(kuò)增片段大小為 457 bp。標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC393(1泳道)和臨床分離株B1～B6(4～9泳道)均在457bp處有明顯的條帶;其它均未擴(kuò)增出條帶(圖3)。

圖3 多殺性巴氏桿菌PCR鑒定Tab.3 PCR identification of Pasteurellosis multocida

2.6 測序結(jié)果

測序結(jié)果為457 bp(圖4中object yak),與唐先春等[8]報道豬多殺性巴氏桿菌序列大小一致。與GenBank中多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因序列比對97%～99%同源性,因此,確定此分離菌為多殺性巴氏桿菌。與參考序列AF016259比對,在第390位上;本研究結(jié)果多了1個 T,在401位上少了1個C,總數(shù)仍為457個堿基。

圖4 分離株 KMT-1基因序列及比對結(jié)果Tab.4 The result of analysis K MT-1 gene sequence of Pasteurellosis multocida

3 討論

1)根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化和實驗室診斷,確診為多殺性巴氏桿菌。由于巴氏桿菌為條件性致病菌,且該病多因冬春兩季氣溫驟變、潮濕、營養(yǎng)缺乏等誘因?qū)е聶C(jī)體抵抗力下降,病原菌侵入機(jī)體,經(jīng)淋巴循環(huán),而發(fā)生內(nèi)源性感染。及早發(fā)現(xiàn)本病,結(jié)合藥敏試驗,可以較好的治愈。平時要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,避免牲畜受寒、擁擠,保持牛場清潔衛(wèi)生,定期殺蟲滅鼠,作好平時的預(yù)防消毒工作。

2)在致病性試驗中小白鼠100%的死亡。因此,在防治過程中除了及時的預(yù)防,還要輔助治療以盡量挽回?fù)p失。根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果來看,其對慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、磺胺等藥物敏感。由于牦牛飼養(yǎng)為野生放牧,其用藥量很少,本次分離的菌耐藥性較低,藥物治療可起到很好的效果。

3)在本實驗多殺性巴氏桿菌生化的鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn),臨床分離株鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌并不完全一致。生化試驗的不穩(wěn)定性和生化項目選擇不全,會導(dǎo)致不準(zhǔn)確性的判定結(jié)果。因此,PCR鑒定是非常理想輔助鑒定手段,本實驗中參考的多殺性巴氏桿菌保守 KM T-1基因(GenBank登錄號:AF016259)合成的引物具有很強(qiáng)的特異性[9]。對葡萄球菌、白色念珠菌、鏈球菌及大腸桿菌和常見上呼吸道革蘭氏陰性菌均不能擴(kuò)增出特異性條帶。

4)在實驗中牦牛多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因序列擴(kuò)增片段大小與 Kirsty M等[9]報道的原始序列大小一致,為 457bp(GenBank登錄號:AF016259),但牦牛多殺性巴氏桿菌 KM T-1基因序列與 GenBank中提交序列均有缺失、增加和突變堿基(圖4),從而導(dǎo)致蛋白序列的變化,這可能是不同地域、不同菌株之間的差異。根據(jù)DNAStar分析部分變化的蛋白存在于預(yù)測的抗原表位上,但是否能引起抗原性的變化,還待進(jìn)一步研究。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

[2]吳范庚,錢心元.我國多殺性巴氏桿菌耐熱抗原血[J].中國獸醫(yī)雜志,1987,13(12):2-4.

[3]蔡寶祥.動物傳染病診斷學(xué)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1993.

[4]陳薄言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[5]郝士海.現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基和生化試驗手冊[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,1992.

[6]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(4):1096-1100.

[7]劉進(jìn)元,常智杰,趙廣榮.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:清華大學(xué)出版社,2002.

[8]唐先春,吳斌,索緒峰,等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(6),590-595.

[9]Kirsty M T ownsend,John D Boyce,Jing Y Chung,et al.Genetic organization ofPasteurella multocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(3):924-929.

Isolation Identification and Sensitive Test of Drug ofPasteurellosis multocidafrom Yak in Xinjiang

KANG Lichao1,TIAN Liang2,ZHANG Xiaoyu2,WANG Pingfu3,BO Xinwen1,MA Xun2
(1 Key Lab of Sheep Reproduction Biotechnology,Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation,Shihezi 832000,China;2 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;3 The Agriculture Division 12 of the Xinjiang Production and Construction Corps,Urumqi 830009,China)

S858.23

A

1007-7383(2010)04-0436-05

2009-08-25

2008年國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃

康立超(1980-),男,助理研究員,從事動物傳染病的診斷與防治研究;e-mail:klc003@163.com。