利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析巢湖鴨群體的遺傳多樣性

趙東偉,湯青萍,李慧芳,陳寬維,陳榮久,馬月輝

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,揚(yáng)州225003;2安徽廬江縣農(nóng)業(yè)開發(fā)委員會(huì),廬江100094;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,北京100094)

利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析巢湖鴨群體的遺傳多樣性

趙東偉1,湯青萍1,李慧芳1,陳寬維1,陳榮久2,馬月輝3

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,揚(yáng)州225003;2安徽廬江縣農(nóng)業(yè)開發(fā)委員會(huì),廬江100094;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,北京100094)

巢湖鴨是我國(guó)著名中型蛋肉兼用品種,為了進(jìn)一步闡明其保種及群體遺傳結(jié)構(gòu)狀況,通過資源調(diào)查摸清了巢湖鴨的外貌特征、生產(chǎn)特性和適宜分布的生態(tài)環(huán)境,采用26個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標(biāo)記,檢測(cè)了巢湖鴨的遺傳多樣性。結(jié)果表明:26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性,總共檢測(cè)到111個(gè)等位基因,平均等位基因數(shù)為4.269個(gè);群體多態(tài)信息含量為0.526,雜合度為0.610。瓶頸效應(yīng)分析結(jié)果表明:該群體已偏離了突變-漂移平衡,近期可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng),種群數(shù)量曾經(jīng)下降。根據(jù)調(diào)查結(jié)果及遺傳多樣性檢測(cè)數(shù)據(jù),提出通過原產(chǎn)地保護(hù),從而保護(hù)巢湖鴨的建議。

巢湖鴨;微衛(wèi)星;遺傳多樣性;保種

Abstract:The Chaohu duck is a famous egg-meat breed with medium-body type in China.Genetic diversity of 26 microsatellite markers were analyzed,Allele frequency,genotypic frequency,heterozygosity,polymorphism information content(PIC)and F-statistics were calculated.The results showed that a total of 111 alleles were distinguished.All the microsatellites were polymorphic,with mean allelic number of 4.269,ranging 2～11 per locus.The expected hererozygosity in the population ranged between 0.096 and 0.849,with a mean of 0.610,indicating considerable genetic variation in this population.Bottleneck analysis indicated that heterozygosis was obvious and group was not in the balance between mutation and excursion for its bottleneck.We suggest that the moderate level of genetic diversity retained in Chaohu populations has the potential to supply sufficient genetic diversity for the species conservation through the recruitment of Chaohu resources in the region.

Key words:Chaohu duck;microsatellite;genetic diversity;conversation

我國(guó)擁有豐富的水禽品種資源,主要分布在長(zhǎng)江流域以及以南地區(qū)的滬、蘇、浙、贛、皖、閩、粵、桂、川、兩湖等11省區(qū)。20世紀(jì)80年代以來,我國(guó)先后培育出了一些生產(chǎn)性能較高的品種(系),水禽業(yè)特別是養(yǎng)鴨業(yè)有了較大規(guī)模的發(fā)展,從國(guó)外引進(jìn)了一些生產(chǎn)性能優(yōu)良的鴨品種,但同時(shí)也對(duì)我國(guó)固有鴨品種資源的保存與利用也帶來了危機(jī)[1]。合理利用和保護(hù)我國(guó)豐富的家鴨品種資源,提高家鴨育種水平,培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的家鴨新品種,是養(yǎng)鴨業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。巢湖鴨作為我國(guó)的著名中型蛋肉兼用品種,屠宰率較高,而且以肉嫩味美著稱。

種群大小的變化,如種群擴(kuò)增或經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后,將會(huì)導(dǎo)致種群遺傳結(jié)構(gòu)的改變,如果忽略這些過程,會(huì)使我們對(duì)種群現(xiàn)在的遺傳結(jié)構(gòu)和種群進(jìn)化過程產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解[2]。巢湖鴨群體在近期是否經(jīng)歷種群大小的變化,經(jīng)歷這種后的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)如何,如何制定合適的保種措施對(duì)巢湖鴨進(jìn)行保護(hù)與管理,是目前受關(guān)注的問題。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多分子標(biāo)記被應(yīng)用于種群遺傳的研究,并有效解決了保護(hù)遺傳學(xué)中的許多問題。其中微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)因具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、選擇中性、易于檢測(cè)、重復(fù)性好、可以提供高分辨率的遺傳信息等特點(diǎn),不僅應(yīng)用于個(gè)體水平上的研究(包括個(gè)體識(shí)別、交配系統(tǒng)和親子分析),而且在種群水平研究上(如種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、基因流、有效種群大小估計(jì)及種群的系統(tǒng)地理發(fā)生分析等方面)倍受關(guān)注。

本研究在國(guó)內(nèi)首次借助微衛(wèi)星DNA標(biāo)記從分子水平對(duì)巢湖鴨品種資源的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳瓶頸效應(yīng)進(jìn)行了研究,以期為今后制定有效的保種措施保護(hù)巢湖鴨提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

巢湖鴨采自安徽廬江縣。采樣設(shè)計(jì)的公母之比為1∶4,其中,公鴨 12只,母鴨 48只,符合Barker等[3]關(guān)于評(píng)估遺傳多樣性抽樣公式和樣本含量的要求。血液基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[4]并稍加改進(jìn)。

1.2 方法

1.2.1 資源調(diào)查方法

資源調(diào)查根據(jù)文獻(xiàn)[5]中的方法進(jìn)行,重點(diǎn)對(duì)禽種的品種特征、生產(chǎn)性能、保種數(shù)量、開發(fā)利用的變化情況以及目前保種的方法、取得的成果等信息逐一進(jìn)行原產(chǎn)地現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。

1.2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)及PCR條件

根據(jù) GenBank和文獻(xiàn)上提供的26對(duì)微衛(wèi)星引物作為實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)[6-8]。實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)合成。微衛(wèi)星 引 物 包 括:APL2、APL11、APL12、APL26、APL36、APL83、APL82、APL81、APL80、APL79、APL78、 APL77、 CMO12、 CMO11、 APH01、APH07、APH09、APH10、APH11、SMO6、SMO7、SMO9、SMO10、SMO11、SMO12、SMO13。

常規(guī)PCR,25μL擴(kuò)增體系,8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,電泳結(jié)束后用硝酸銀染色。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsatellite-Toolkit軟件[9]計(jì)算等位基因頻率、觀察雜合度與期望雜合度。根據(jù) FSTAT程序計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星座位的群體內(nèi)遺傳分化系數(shù)FIS,由Benferroni程序計(jì)算 FIS的顯著性。并根據(jù)公式計(jì)算各鴨品種中的多態(tài)信息含量(polymorplism information content,PIC)。

用2種不同的方法來檢測(cè)巢湖鴨近期是否經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)。一種是根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率,基于無限等位基因模型(the infinite allele,IAM)、逐步突變模型(stepwise mutation,SMM)和雙相突變模型(two phased,TPM),通過符號(hào)檢驗(yàn)(sign test)、標(biāo)準(zhǔn)化差異檢驗(yàn)(standardized differences test)和 Wilcoxon符號(hào)秩次檢驗(yàn)(wilcoxon sign-rank test)分析雜合過度是否顯著;另一種方法是Cornuet等[10]采用的模式遷移的圖形表示法。這2種方法均由Bottleneck v1.2.02分析軟件(http://www.ensam.inra.fr/URLB)分析得出[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生態(tài)環(huán)境和外貌特征

2.1.1 生態(tài)環(huán)境

巢湖鴨主產(chǎn)地為安徽省中部、巢湖周圍的廬江、巢縣、肥東、肥西、舒城、無為、和縣、含山等縣。主產(chǎn)區(qū)位于江淮分水嶺以南、大別山以東、長(zhǎng)江北岸以巢湖為中心的低洼湖沼沖積平原,境內(nèi)圩田棋布,河渠縱橫,湖泊塘壩繁多,水面20萬hm2,占該地區(qū)總面積的20%左右。該地區(qū)氣候溫和,水量充沛,土地肥沃。年平均氣溫為16℃,無霜期為240 d,成年降水量為966 mm。該地區(qū)為長(zhǎng)江流域水稻主產(chǎn)區(qū)之一,素稱“安徽糧倉”。豐富的水生動(dòng)植物飼料資源和大面積水田及收獲時(shí)的遺谷,為放牧養(yǎng)鴨提供了充足而廉價(jià)的飼料。

2.1.2 外貌特征

巢湖鴨體型中等大小,勻稱緊湊,頸細(xì)長(zhǎng),體軀長(zhǎng)方,羽毛緊密。公鴨頭頸上部墨綠色帶有光澤,前胸和背腰褐色帶黑色條斑,腹部白色,臀部黑色,稱為“綠頭粉襠”;喙黃綠;虹彩褐色;脛、蹼橘紅色,爪黑色。母鴨全身羽毛淺褐色帶黑色細(xì)花紋,稱淺麻細(xì)花;眼上方有白或淡黃眉紋;翅膀有藍(lán)綠色鏡羽;喙有黃、黃綠、黃褐等色;虹彩褐色;脛、蹼橘紅色,爪黑色。

2.1.3 生產(chǎn)特性

該區(qū)農(nóng)民歷來從事棚鴨飼養(yǎng),以放牧為主、補(bǔ)飼為輔的養(yǎng)鴨方式,使該品種具有體質(zhì)健壯、行動(dòng)敏捷、抗逆性和覓食能力強(qiáng)的特點(diǎn)。成年公鴨體重2420 g左右,母鴨體重2130 g;270日齡屠宰率:半凈膛 ,公 83.8%,母 84.4%;全凈膛 ,公 72.6%,母73.4%。開產(chǎn)日齡150 d,產(chǎn)蛋以白色居多,青色較少,年產(chǎn)蛋160～180枚,蛋重70 g/枚。

2.1.4 保護(hù)狀況

根據(jù)2002年最新資源調(diào)查,巢湖鴨現(xiàn)采用保種區(qū)保護(hù),在保種區(qū)內(nèi)存欄200萬只左右,屬正常保種狀態(tài)[12],開發(fā)利用情況較好。

2.2 群體及各微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)

由表1可見,26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性,總共檢測(cè)到111個(gè)等位基因。

單個(gè)座位的等位基因數(shù)從2到11不等,等位基因數(shù)最多的位點(diǎn)為APL2(11個(gè)),平均數(shù)4.269個(gè)。

CM011座位的期望雜合度和 PIC值最低,為0.096和0.090;而APL2座位則擁有最高的期望雜合度和 PIC值,為0.849和0.822;平均多態(tài)信息含量為0.526,平均雜合度為0.610。

群體內(nèi)遺傳分化系數(shù)FIS從-1.000到1.000不等,有21個(gè)座位表現(xiàn)為雜合子剩余,5個(gè)座位表現(xiàn)為雜合子缺失,從總體來看,巢湖鴨表現(xiàn)出了顯著的雜合子剩余狀態(tài)(FIS=-0.461,P<0.01)。

表1 巢湖鴨在26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Tab.1 Genetic paramters of 26 microsatellite loci in Chaohu duck

2.3 瓶頸效應(yīng)

基于IAM、TPM和SMM的假設(shè),得到巢湖鴨在3種突變模型下期望雜合度 HEQ。3種檢驗(yàn)方法下 P值均達(dá)到極顯著水平,說明巢湖鴨群體在近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng),這點(diǎn)也可以從模式遷移圖看出,本研究所得的圖1并不符合標(biāo)準(zhǔn)的L-型分布。

表2 雜合子剩余或缺失的位點(diǎn)數(shù)以及3個(gè)模型分析瓶頸效應(yīng)的 P值Tab.2 Number of loci showing heterozygosity excess or deficiencyin and P value of bottleneck effect under 3 mutation models of IAM,TPM and SMM

圖1 巢湖鴨遺傳瓶頸效應(yīng)分析的模式遷移Fig.1 The migration mode of bottleneck effect in Chaohu duck

3 討論

3.1 品種的遺傳多樣性

1)多態(tài)信息含量是衡量片段多態(tài)性的較好指標(biāo)。Botstein等[13]首先提出了用多態(tài)信息含量指標(biāo)衡量基因變異程度的高低:當(dāng) PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn);0.25

本研究結(jié)果表明,所選26個(gè)微衛(wèi)星中的13個(gè)為高度多態(tài),12個(gè)為中度多態(tài),1個(gè)為低度多態(tài)。群體在26個(gè)微衛(wèi)星座位中19個(gè)符合H-W平衡,說明本次所選用的為衛(wèi)星標(biāo)記可作為有效的遺傳標(biāo)記用于遺傳多樣性分析,同時(shí)也說明本次試驗(yàn)所抽取的樣本及數(shù)目能夠反映群體的實(shí)際情況。

2)遺傳雜合度又稱基因多樣度,反映各群體在n個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異。一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的1個(gè)最適參數(shù)。

本研究結(jié)果表明:巢湖鴨的雜合度為0.610遺傳多樣性相對(duì)較高,選擇的潛力相對(duì)較大,在保持原有品種特征的前提下可做必要的品種純合選育。

3.2 保種與選育的探討

1)當(dāng)群體有較大的減少時(shí),會(huì)導(dǎo)致等位基因的丟失和群體雜合度的過量或缺失,這一現(xiàn)象被稱為瓶頸效應(yīng)。群體在經(jīng)歷遺傳瓶頸的過程中,等位基因多樣性減少較雜合度減少要快,而且這一作用將保持?jǐn)?shù)代直至群體再次回到遺傳平衡狀態(tài),因此可以用雜合度過量對(duì)群體是否經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè);另外,某一位點(diǎn)上等位基因數(shù)目對(duì)群體大小的波動(dòng)也較敏感,也可以作為瓶頸效應(yīng)檢測(cè)的一種標(biāo)志。

本研究的瓶頸效應(yīng)分析結(jié)果表明,巢湖鴨在近期經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)。處于突變-漂移平衡下的種群,微衛(wèi)星位點(diǎn)顯示雜合過剩與雜合不足的概率應(yīng)大致相等。

2)種群在進(jìn)化中經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后,等位基因和基因多樣性(雜合度)均會(huì)降低,其中等位基因丟失比雜合度降低速度快,從而導(dǎo)致雜合過剩。因此,通過雜合度是否過剩分析可以判斷種群數(shù)量是否下降。對(duì)一個(gè)種群是否具有顯著數(shù)量的雜合過剩的位點(diǎn),常用此方法來進(jìn)行檢驗(yàn),即符號(hào)檢驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)差檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩次檢驗(yàn)。

本研究用3種方法檢驗(yàn)均得到了同樣的結(jié)果,P值均達(dá)到極顯著水平,這表明巢湖鴨在近期經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng),種群數(shù)量曾經(jīng)下降,故需要采取措施來對(duì)巢湖鴨進(jìn)行保護(hù)和管理。

3)巢湖鴨在原產(chǎn)地并未受到高強(qiáng)度的選擇,在實(shí)際中基本以本品種利用為主,受到外來鴨種的影響較小。巢湖鴨品種資源的遺傳多樣性較豐富,在作好保種工作的同時(shí),可向不同方向選育專門化的品系,加強(qiáng)這些品種的開發(fā)力度,以滿足商業(yè)生產(chǎn)的需求。實(shí)現(xiàn)以品種的開發(fā)利用來支持種質(zhì)資源的保存,既保了種又充分發(fā)揮了品種資源的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì),這必將促進(jìn)鴨業(yè)的發(fā)展。

據(jù)清乾隆年間就有生產(chǎn)的著名佳肴“無為熏鴨”的歷史推斷,巢湖鴨的形成已有200年以上的歷史。保護(hù)利用好這一古老的地方鴨種,是廣大畜牧工作者的責(zé)任。物種的保護(hù)既要考慮其生存的生態(tài)系統(tǒng),又要考慮品種內(nèi)遺傳多樣性的完整性,水禽的保護(hù)尤其要注意這一點(diǎn)。

[1]齊景發(fā),賈幼陵,何新天,等.中國(guó)畜禽遺傳資源狀況[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004,16.

[2]Estoup A,Angers B.Microsatellites and minisatellites for molecular ecology:theoretical and empirical considerations[C].Carvalho G R.Advances in moleculae ecology,Press,Amsterdam:Nato Sciences Series IOS,1998:55-86.

[3]Barker P S F.A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds[J].Proceeding of 5th World Congress on Genetic Application of Livestock Production,1994,21:501-508.

[4]薩姆布魯克,弗里奇,曼尼阿帝斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[5]陳偉生.畜禽遺傳資源調(diào)查技術(shù)手冊(cè)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005.

[6]Weber J L.Infomativeness of human(dC-dA)n·(dG-dT)n polymorphisms[J].Genomics,1990,7:524-530.

[7]Maak S,Neumann K,Von Lengerken G,et al.First seven microsatellites developed for the Peking duck(Anas platyrhynchos)[J].Anim Genet,2000,31(3):233.

[8]Paulus B K,Tiedemann R.T en polymorphic autosomal microsatellite loci for the Eider duck Somateria mollissima and their cross-species applicability among waterfowlspecies(Anatidae)[J].Molecular Ecology,2003,3:250-252.

[9]Park S D E.Trypanotolerance in west African cattle and the population genetic effects of selection[D].Dublin:University of Dublin,2001.

[10]Cornuet J M,Luikart G.Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data[J].Genetics,1996,144,2001-2014.

[11]Piry S,Luikart G,Cornuet J M.Bottleneck:a computer program for detecting recent reductions in the effective population size using allele frequency data[J].J Hered,1999,90,502-503.

[12]FAO.FAO Programmes for the preservation of animal genetic resources-a report of the expert consultation[R].Rome:FAO,1989.

[13]Botstein D,WhiteR L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restrictionfragment length polymorphisms[J].AmJ Hum Genet,1980,32:314-331.

An Analysis of the Genetic Diversity of the Chaohu Duck by Using Microsatellite Markers

ZHAO Dongwei1,TANG Qingping1,LI Huifang1,CHEN Kuanwei1,CHEN Rongjiu2,MA Yuehui3
(1 Institute of Poultry Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Yangzhou 225003,China;2 Committee of Agricultural Development of Lujiang County,Anhui Province,Lujiang 100094,China;3 Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100094,China)

S188

A

1007-7383(2010)04-0427-05

2009-05-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADB2B08),江蘇省科技服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(BM2008170)

趙東偉(1972-),男,助理研究員,從事家禽遺傳資源及育種研究;e-mail:yzzdw0316@163.com。

陳寬維(1955-),男,研究員,從事家禽遺傳育種與家禽資源保護(hù)研究;e-mail:ckw0079@163.com。