Neurospora.crassa降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵工藝研究

肖玉娟，鄧澤元*，范亞葦，李 靜，劉 蓉，胡蔣寧

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

Neurospora.crassa降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵工藝研究

肖玉娟，鄧澤元*，范亞葦，李 靜，劉 蓉，胡蔣寧

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

以提取茶皂素后的茶粕為材料，研究Neurospora.crassa(粗壯脈紋胞菌)降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定豆渣、米糠、含水量及發(fā)酵時間進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken實驗，建立粗纖維降解率的二次回歸方程，通過響應(yīng)面分析得到優(yōu)化組合工藝條件。結(jié)果表明：最佳的茶粕發(fā)酵條件為豆渣添加量29.38%、米糠添加量18.54%、含水量72%、發(fā)酵時間74.9h時，培養(yǎng)基粗纖維降解率達(dá)到最大值。該條件下粗纖維降解率預(yù)測值為48.65%，驗證值為48.36%。

粗壯脈紋胞菌；茶粕；發(fā)酵條件；響應(yīng)曲面法優(yōu)化

茶粕，又稱茶籽餅、茶麩、茶枯，呈紫褐色顆粒，是山茶科植物的果實榨油后剩下的渣，其中油茶茶籽粕和茶葉茶籽粕產(chǎn)量較大，其年均總產(chǎn)量約70萬t，是潛在的可利用茶粕資源[1]。目前，茶籽主要采用傳統(tǒng)的壓榨法榨油工藝制油, 所生產(chǎn)的茶粕中茶皂素、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過高，不適宜直接用于動物飼料生產(chǎn)，大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，少量用于茶皂素的提取，極少部分用于飼料資源的開發(fā)應(yīng)用[2]。茶粕如果去除了有毒物質(zhì)茶皂素，其營養(yǎng)價值可與米糠媲美，且經(jīng)過微生物發(fā)酵后，可得到較高的菌體蛋白，提高了茶粕的利用價值[3]。因此，本實驗采用提取茶皂素(本課題組的專利技術(shù))后的茶粕為主要原料，利用實驗室自行篩選的一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維，以期在茶粕的動物飼料開發(fā)利用方面提供一種更為有效的途徑。

響應(yīng)面分析(response surface methodology) 法是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具[4]，將實驗中多因素與指標(biāo)的相互關(guān)系作近似擬合，可同時對影響生物產(chǎn)量的各因素水平及其交互作用進(jìn)行評價與優(yōu)化[5]。因此它能快速有效地確定多因子系統(tǒng)中的最優(yōu)條件，該法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[6]。本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選出對粗壯脈紋孢菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維具有顯著作用的4個因素的3個水平進(jìn)行Box-Behnken試驗，通過響應(yīng)面分析確定其最佳值、優(yōu)化工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)由本實驗室篩選保存。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、移液器、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、電子天平、干燥箱、廣口瓶、調(diào)溫電熱套等。

1.3 培養(yǎng)基

斜面固體培養(yǎng)基：2%蛋白胨、 4%麥芽糖、1.5%～1.8%瓊脂，pH5.5～6.0。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO41g、pH值自然，蒸餾水定容到1 L。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

從新鮮菌體活化培養(yǎng)基上取1環(huán)菌接入種子液培養(yǎng)基(30mL/250mL錐形瓶)，于30℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)3 6 h，備用。

1.4.2 發(fā)酵方法

在茶粕培養(yǎng)基中配入相應(yīng)比例的豆渣和米糠，裝入200mL的廣口瓶中，料層厚度控制在3～4cm，按不同的料水比加入水?dāng)噭颍邏簻缇?。接?mL/100g的種子液于固體培養(yǎng)基中，將廣口瓶置于恒溫恒濕箱中，在溫度為30℃，濕度為70%的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵[7]。

1.4.3 含水量的測定

茶粕培養(yǎng)基中配入豆渣和米糠后，加水浸潤，置于廣口瓶中，并用紗布和報紙蓋上，放入高壓滅菌鍋后，121℃滅菌30min。滅菌后的培養(yǎng)基105℃烘干至質(zhì)量恒定[8]，含水量的計算公式如下：

式中：m1為滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；m2為干燥后培養(yǎng)基的質(zhì)量。

1.4.4 粗纖維的含量測定及降解率的計算

茶粕固態(tài)發(fā)酵樣品粉碎過篩孔尺寸為0.425mm的篩子，混勻后先用煮沸的體積分?jǐn)?shù)為1.25%的稀硫酸處理，以去除其中的糖、淀粉、果膠等酸溶性物質(zhì)，再用煮沸的體積分?jǐn)?shù)為1.25%的氫氧化鈉溶液處理，以除去蛋白、脂肪等堿溶性物質(zhì)。最后用95%乙醇和無水乙醚處理除去單寧、色素以及殘余的脂肪，105℃烘干后所得殘渣即為粗纖維[9]。

式中：m1為培養(yǎng)基發(fā)酵前粗纖維總質(zhì)量/g；m2為培養(yǎng)基發(fā)酵后粗纖維總質(zhì)量/g。

1.5 粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 單因素對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率的影響

影響粗壯脈紋胞菌生長及粗纖維降解率的因素很多[10]，如添加的豆渣比例、米糠比例、培養(yǎng)基含水量、初始pH值及發(fā)酵時間等。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11-12]，選用豆渣10%、米糠20%、初始pH值自然、含水量68%、發(fā)酵時間72h為基本參數(shù)。確定一項最優(yōu)條件后，后續(xù)試驗均按前面的優(yōu)化值來進(jìn)行試驗。

1.5.2 Box-Benhnken中心組合試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定影響粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的顯著因素，采用Box-Benhnken試驗設(shè)計進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化[13]。得到的數(shù)據(jù)采用SAS 8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，當(dāng)P＜0.05時為顯著性水平。

1.5.3 驗證實驗

將優(yōu)化實驗所得的數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行回歸擬合，確定其極值點(diǎn)及其相應(yīng)自變量的取值，并進(jìn)行驗證實驗及可靠性分析。重復(fù)3次，用平均值進(jìn)行驗證比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶粕發(fā)酵過程中單因素對粗纖維降解率的影響

2.1.1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響

圖1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響Fig.1 Effect of soybean residue on the degradation rate of crude fiber

如圖1所示，粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢，當(dāng)向培養(yǎng)基中添加20%以上的豆渣時，粗纖維的降解率增幅減小，上升緩慢。為了多利用茶粕，故選擇豆渣比例為20%。

2.1.2 米糠比例對粗纖維降解率的影響

如圖2所示，粗纖維降解率隨米糠比例的增加，呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢，在添加量為20%附近出現(xiàn)最大值。

圖2 米糠比例對粗纖維降解率的影響Fig.2 Effect of rice bran on the degradation rate of crude fiber

2.1.3 初始pH值對粗纖維降解率的影響

如圖3所示，培養(yǎng)基的pH值會影響微生物的生長和酶的穩(wěn)定性，粗纖維降解率在初始pH6.0左右達(dá)到最大值，此后隨著pH值上升而逐漸降低，特別是pH值為8.0時，粗纖維降解率顯著降低。由于培養(yǎng)基的自然pH值在5～6之間，故選擇自然pH值發(fā)酵。

2.1.4 含水量對粗纖維降解率的影響

圖4 含水量對粗纖維降解率的影響Fig.4 Effect of water content on the degradation rate of crude fiber

如圖4所示，粗纖維降解率隨培養(yǎng)基含水量的增加，呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，且增減幅度明顯，在含水量為70%附近達(dá)到最大值。初步確定含水量在70%時發(fā)酵效果最佳。

2.1.5 發(fā)酵時間對粗纖維降解率的影響

圖5 發(fā)酵時間對粗纖維降解率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the degradation rate of crude fiber

如圖5所示，發(fā)酵時間是影響發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量的一個重要參數(shù)[14]，主要取決于微生物的生長和代謝速率，還取決于基質(zhì)中的營養(yǎng)成分及內(nèi)部環(huán)境[15]。發(fā)酵時間太短，微生物不能充分利用碳源來生長，達(dá)不到理想的粗纖維降解效果；發(fā)酵時間太長，則生產(chǎn)周期變大，生產(chǎn)成本變高，而且容易滋生雜菌。在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)品中粗纖維的含量逐漸減少，當(dāng)發(fā)酵時間為72h后，產(chǎn)品的粗纖維降解率增幅很低，故選用發(fā)酵時間72h左右為宜。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化粗纖維降解率工藝條件

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗所得結(jié)果，確定發(fā)酵pH值為自然，選取豆渣比例、米糠比例、含水量和發(fā)酵時間4個對粗纖維降解率影響顯著的因素，分別以X1、X2、X3和X4代表，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼(表1)。以茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率為響應(yīng)值(Y)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

對豆渣比例X1、米糠比例X2、含水量X3和發(fā)酵時間X4作變換如下：X1=(A－20)/10，X2=(B－20)/10，X3=(C－70)/10，X4=(D－72)/12。以X1、X2、X3和X4為自變量， 以3次試驗所得粗纖維降解率的平均值為響應(yīng)值(Y)，得到結(jié)果見表2，其中1～24是析因試驗，25～27是中心試驗，用來估計實驗誤差。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

從表3的回歸分析結(jié)果可以看出，用上述的回歸模型描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，模型4個因素的P值均小于0.01，失擬項P=0.080434＞0.05，表明該模型顯著；回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9662，表明該模型與實際實驗擬合較好，因此該模型可用于該菌對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解的分析和預(yù)測?；貧w方程各項的方差分析結(jié)果還表明，自變量(豆渣比例、米糠比例、含水量和發(fā)酵時間)與響應(yīng)值(粗纖維降解率)之間線性關(guān)系極顯著(P＜0.01)；含水量對粗纖維降解率的曲面效應(yīng)極顯著；豆渣比例與米糠比例、豆渣比例與含水量的交互作用也極顯著；而X12、X22、X42、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4的作用不顯著。

表3 響應(yīng)面試驗回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率模型進(jìn)行求導(dǎo)和解逆矩陣可以得到模型的極值點(diǎn)，豆渣為29.38%、米糠為18.54%、含水量為72%、發(fā)酵時間74.9h時，此時模型預(yù)測的最大響應(yīng)值為48.65%。

2.3 驗證實驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在上述響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)化條件和原始菌體生長條件下進(jìn)行發(fā)酵實驗，重復(fù)3次實驗所得茶粕培養(yǎng)基粗纖維的降解率為48.36%，與模型預(yù)測的最佳值基本吻合。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討 論

3.1 培養(yǎng)基一定的載氧能力有利于粗壯脈紋胞菌的生長

單因素試驗表明粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基中豆渣比例超過20%時，粗纖維的降解率增幅減小，上升緩慢；同樣粗纖維降解率隨米糠比例的增加，呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在米糠比例20%附近出現(xiàn)最大值。響應(yīng)面優(yōu)化得到豆渣為29.38%、米糠為18.54%時，粗壯脈紋胞菌生長好、粗纖維降解率最大。粗壯脈紋胞菌為需氧菌，培養(yǎng)基一定的載氧能力有利于該菌的生長和發(fā)育；而豆渣富含淀粉和纖維、米糠也富含纖維，他們的添加可以改善培養(yǎng)基的載氧能力，因此蓬松的原料有利于該菌的生長。在固態(tài)發(fā)酵中，適宜的發(fā)酵含水量，使得基質(zhì)顆粒之間膨松有空隙，疏松度合適，有助于菌體從中獲得營養(yǎng)及氧氣的傳遞。但是過高的含水量會導(dǎo)致基質(zhì)黏結(jié)成團(tuán)，通氣性下降，影響氧的傳遞，導(dǎo)致酶活下降；而含水量過低，水的活度下降，不利于物質(zhì)傳遞，從而抑制粗壯脈紋胞菌對粗纖維的降解過程。

3.2 茶粕通過粗壯脈紋胞菌發(fā)酵是一種較好的飼料資源

我國可利用的茶粕資源十分豐富，但目前對茶粕的研究報道，大多專注于活性物質(zhì)茶皂素的提取，而把茶粕發(fā)酵成飼料的報道較少。通過脫茶皂素加工工藝生產(chǎn)的茶粕是一種良好的飼料原料。它含有多種對動物生長發(fā)育有利的必需微量元素，其中Mg、Ca、Fe、Zn、K、Cu的含量分別為：2730、1230、268.4、29.7、14790、17.28mg/kg；而據(jù)劉彥明等[16]的研究報道，茶粕中的有害元素Pb、Cd 的含量卻很低或近于零。經(jīng)粗壯脈紋胞菌發(fā)酵生產(chǎn)的茶粕發(fā)酵產(chǎn)品，粗纖維含量降低，從初始的21.52%降至14.15%，部分纖維素和木質(zhì)素成為了易消化的單糖或?qū)δc道細(xì)菌有益生作用的低聚糖，經(jīng)檢測，可溶性糖含量由初始的7.6%提高至35.97%。發(fā)酵后的粗蛋白含量提高，從初始的12.82%提高至18.34%，茶粕中的非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體真蛋白，產(chǎn)品的營養(yǎng)價值得到較大的提升。另外，粗壯脈紋胞菌是一株產(chǎn)β-胡蘿卜素能力較強(qiáng)的菌，其發(fā)酵后培養(yǎng)基中β-胡蘿卜素含量可達(dá)100mg/kg以上，這使茶粕發(fā)酵產(chǎn)品同時有望成為一種良好的蛋禽天然色素飼料?？傊?，在動物生產(chǎn)中科學(xué)合理地使用茶粕發(fā)酵產(chǎn)品有利于緩解我國飼料資源緊缺的局面。

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Fermentation Processing of Fiber Degradation from Oil-tea-cake Residue byNeurospora. crassa

XIAO Yu-juan，DENG Ze-yuan*，F(xiàn)AN Ya-wei，LI Jing，LIU Rong，HU Jiang-ning

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute for Advanced Study, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

The fermentation processing for fiber degradation from the residue of oil-tea-cake after the extraction of tea saponin was investigated. According to results of single-factor experiments, soybean residue, rice bran, water content and fermentation time were selected for the Box-Behnken design to establish a quadric regression equation for describing the degradation of fiber.The optimal fermentation conditions were achieved by response surface analysis to be soybean residue of 29.38%, rice bran of 18.54%, water content of 72% and fermentation time of 74.9 h. Under the optimal fermentation conditions, the highest degradation of fiber reached up to 48.65%, which was consistent with 48.36% of the validated value.

Neurospora. crassa；oil-tea-cake；fermentation processing；response surface methodology

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0243-05

2010-07-23

2010年江西省科技重大專項；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室目標(biāo)導(dǎo)向課題(SKLF-MB-201003)

肖玉娟(1986—)，女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：xiaoyujuan0520@163.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，主要從事脂肪酸及天然產(chǎn)物研究。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn