酶法水解香/芭蕉根部球莖粉漿研究及動力學(xué)分析

陳 偉，黃廣民*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228)

酶法水解香/芭蕉根部球莖粉漿研究及動力學(xué)分析

陳 偉，黃廣民*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

考察香/芭蕉根部球莖粉漿酶法水解液化過程，采用液態(tài)高溫α-淀粉酶，在高溫條件下作用于香/芭蕉根部球莖粉漿，通過單因素和正交試驗，分別檢測水解液中還原糖含量，以考察其作用情況。結(jié)果表明：液化溫度85℃、粉漿pH6.4、香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度30mg/mL、加酶量0.064mL/g，酶法水解液化效果最佳，Vm為0.708mg/(mL·min)，Km為27.410mg/mL，水解液的DE值達到37.61%。

香/芭蕉根部球莖；高溫α-淀粉酶；動力學(xué)

香/芭蕉是生物量極大的植物，其莖稈包括根部球莖和假莖稈兩部分。球莖俗稱香/芭蕉頭，是著生根系、葉片和吸芽的部位，是整個植株養(yǎng)分產(chǎn)生和貯藏的部位，供根系、葉片、吸芽、花果的生長和發(fā)育。據(jù)估計每畝產(chǎn)鮮莖稈≥40噸。其中鮮根部球莖≥15噸；鮮假莖稈≥25噸，每畝產(chǎn)莖稈干物質(zhì)≥4噸，其中根部球莖干物質(zhì)≥1.5噸。然而香蕉收獲后，人們常將香蕉根部球莖全部挖除更新，重新種植來年才有好的收成[1]。若能充分利用這一廢棄資源生產(chǎn)燃料乙醇，變廢為寶，必將對減少環(huán)境污染、改善生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)低碳經(jīng)濟具有重要意義，并為香/芭蕉重復(fù)種植和根除病源病害、大幅度提高香/芭蕉產(chǎn)量和品質(zhì)、增加農(nóng)民收入、提高蕉園利用率，促進高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供一定參考。

經(jīng)初步分析，香/芭蕉根部球莖含有豐富的果膠質(zhì)、淀粉質(zhì)、雜多糖、半纖維素和纖維素等碳水化合物，其水解后，水解液含有葡萄糖、甘露糖、果糖等糖類，可用于發(fā)酵制備燃料乙醇。其水解方法有酸水解法、酶水解法、酶和酸混合水解法，水解方法和水解的工藝條件直接關(guān)系到燃料乙醇產(chǎn)率，關(guān)系到該原料的有效利用率。

液態(tài)高溫α-淀粉酶是一種新型液化型酶制劑，具有優(yōu)越的熱穩(wěn)定性，在果葡糖漿和酒精的生產(chǎn)中，它可使糧食淀粉糊化和液化同時進行，大大簡化和縮短工藝過程。香/芭蕉根部球莖具有不同于糧食淀粉的組織結(jié)構(gòu)，液態(tài)高溫α-淀粉酶能否在高溫下水解和液化香/芭蕉根部球莖粉漿，使其轉(zhuǎn)化為低聚糖和單糖等可發(fā)酵物質(zhì)，是該原料生產(chǎn)燃料乙醇亟待解決的重要問題[2-4]。利用液態(tài)高溫α-淀粉酶，酶解液化香/芭蕉根部球莖粉漿的研究，尚未見文獻報道，因此本研究旨在探討使香/芭蕉根部球莖粉漿一步液化和糖化、縮短燃料乙醇制備的工藝過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香/芭蕉根部球莖干粉的制備：新鮮的香/芭蕉根部球莖，切片，烘干，粉碎，過篩至80～100目，控制水分含量小于10%，備用。

鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、葡萄糖等試劑均為分析純及以上純級；液態(tài)高溫α-淀粉酶(3000U/mL) 山東棗莊市杰諾生物酶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721-型分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；280-型齒爪式粉碎機 廣州廣萊農(nóng)業(yè)機械設(shè)備有限公司；601BS-型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市晨陽電子儀器廠。

1.3 香/芭蕉根部球莖粉漿酶水解液中還原糖測定方法的建立

為準確、方便、快捷地跟蹤檢測液態(tài)高溫α-淀粉酶在高溫下作用于香/芭蕉根部球莖粉漿水解液中還原糖含量的變化，有必要建立一套適合于本工藝要求的還原糖測定方法。本實驗以葡萄糖為標準，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)為顯色劑，采用分光光度法測定酶水解液中還原糖的含量[5-7]，其測定方法簡述如下：

稱取經(jīng)干燥后的葡萄糖0.1000g，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度1.0mg/mL的標準葡萄糖溶液。在0～10.0mL范圍內(nèi)，按1.0mL增序，分別準確吸取一定量的葡萄糖標準溶液于25mL容量瓶，加入2.0mL DNS溶液，2.0mL蒸餾水，使葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40mg/mL，于100℃水浴中加熱5min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋定容。選擇1cm比色皿，在490nm波長處測定吸光度，同時做空白實驗。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)。并得回歸方程為y=1.140x－ 0.042(R2=0.999)。

圖1 葡萄糖含量測定標準曲線Fig.1 Standard curve for glucose determination

1.4 香/芭蕉根部球莖粉漿水解液還原糖含量測定

精確稱量5.000g香/芭蕉根部球莖干粉于三頸燒瓶中，加入一定pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調(diào)成漿狀，裝上回流冷凝管，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶，控制粉漿總體積為100mL，以不同的水解溫度、不同的香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度、不同的水解時間進行水解實驗。分別按酶解20min的時間增序，取0.5g樣液于25mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，分別吸取2.0mL水解稀釋液于50mL容量瓶，加入2.0mL DNS顯色劑，于100℃水浴中加熱5min顯色，迅速冷卻，用蒸餾水稀釋定容。選用1cm比色皿，在490nm波長處，測定香/芭蕉根部球莖粉漿酶水解液的吸光度，按標準回歸曲線計算還原糖含量，以DE值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 液態(tài)高溫α-淀粉酶反應(yīng)條件的分析

2.1.1 粉漿酸度對香/芭蕉根部球莖粉漿中多糖水解的影響

分別稱取香/芭蕉根部球莖干粉5.000g，加入一定體積pH值為4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，控制香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度為50mg/mL，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量為0.064mL/g，于80℃恒溫水解，按1.4節(jié)方法檢測水解液中還原糖含量，考察粉漿酸度對香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖水解的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 粉漿酸度對香/芭蕉根部球莖粉漿水解的影響Fig.2 Effect of pH of added citric acid/disodium hydrogen phosphate buffer on DE

由圖2可見，粉漿pH＜6.0時，隨著酸度的增大，液態(tài)高溫α-淀粉酶的活性很小，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖幾乎沒被酶水解，水解液中還原糖含量很??；當粉漿pH＞6.0時，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解量隨酸度的增大而增大，水解液中還原糖含量呈急劇增大，且當粉漿pH6.4時達到最大值。此后，隨著粉漿酸度增大，香/芭蕉根部球莖粉漿酶水解液中還原糖含量呈線性下降。因此，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解液化最佳pH值為6.4。

2.1.2 加入液態(tài)高溫α-淀粉的量對香蕉根部球莖粉漿中多糖水解的影響

分別稱取香/芭蕉根部球莖干粉5.000g，加入一定體積pH6.4檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖溶液，控制香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度為50mg/mL，水解溫度80℃，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量分別為0.016、0.032、0.048、0.064、0.096mL/g。按1.4節(jié)方法檢測水解液中還原糖含量，考察加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量對香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖水解的影響，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 高溫α-淀粉酶的添加量對香/芭蕉根部球莖粉漿水解的影響Fig.3 Effect of enzyme loading on DE

由圖3可見，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量小于0.064mL/g時，隨著酶添加量的增加，香/芭蕉根部球莖粉漿水解液中還原糖含量呈線性緩慢增大，當加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量＞0.064mL/g時，再繼續(xù)增加酶的量，香/芭蕉根部球莖粉漿水解液中還原糖含量幾乎保持不變，其水解液的DE值幾乎是一組平行于橫坐標的直線，而酶添加量為0.064mL/g，是香/芭蕉根部球莖粉漿中多糖水解曲線的一個拐點。因此，酶添加量應(yīng)以0.064mL/g為宜。

2.1.3 溫度對香/芭蕉根部球莖粉漿中多糖水解的影響

圖4 水解溫度對香/芭蕉根部球莖粉漿水解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DE

分別稱取香/芭蕉根部球莖干粉5.000g，加入一定體積pH6.4檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，控制香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度為50mg/mL，為0.064mL/g，分別以65、75、80、85、90℃恒溫水解。按1.4節(jié)方法檢測水解液中還原糖含量，考察粉漿溫度對香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖水解的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，水解溫度＜75℃時，液態(tài)高溫α-淀粉酶的活性很小，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖水解的速率緩慢，水解液中還原糖含量很小。當水解溫度在75～85℃時，隨著水解溫度的增大，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶水解速度迅速增加，水解液中還原糖含量(DE值)呈線性急劇增大。當水解溫度至85℃時，水解液中還原糖含量達到最大值。當水解溫度＞85℃，隨著水解溫度的增大，香/芭蕉根部球莖粉漿的水解液中還原糖含量呈線性下降。表明液態(tài)高溫α-淀粉酶在水解溫度＞85℃時其活性下降或鈍化。因此，液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖，最佳溫度應(yīng)為85℃。

2.1.4 底物質(zhì)量濃度對香蕉根部球莖粉漿中多糖水解的影響

底物質(zhì)量濃度[S]指香/芭蕉根部球莖粉漿的質(zhì)量濃度，它是影響其中的多糖水解的重要因素之一。分別稱取一定量的香/芭蕉根部球莖干粉，加入pH6.4檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物質(zhì)量濃度[S]分別控制在10、20、30、40、50、60、80mg/mL，α-淀粉酶量為0.064mL/g，水解溫度85℃。按1.4節(jié)方法檢測水解液中還原糖含量，考察底物質(zhì)量濃度[S]對香/芭蕉根部球莖中多糖水解的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 底物質(zhì)量濃度對香/芭蕉根部球莖粉漿水解的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on DE

由圖5可見，香/芭蕉根部球莖粉漿的質(zhì)量濃度＜20mg/mL時，其水解液中還原糖的含量隨底物質(zhì)量濃度的增大呈線性增大，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度達到20mg/mL時，香/芭蕉根部球莖粉漿水解液中還原糖含量接近達到最大值。香/芭蕉根部球莖粉漿的質(zhì)量濃度＞30mg/mL時，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，水解度呈線性減少。因此，香/芭蕉根部球莖粉漿酶水解時，液態(tài)高溫α-淀粉酶的量和底物質(zhì)量濃度的最佳配比為0.31:1，此時水解液中還原糖含量(DE值)可達到37.61%。

2.2 液態(tài)高溫α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球莖粉漿的動力學(xué)特性分析

根據(jù)酶水解液中還原糖含量和香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度對應(yīng)的曲線簇，選擇較具有代表性的水解時間40min，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解后，水解液中還原糖含量的曲線，分別計算單位時間內(nèi)還原糖的生成量，即以還原糖的生成速率隨著底物質(zhì)量濃度的關(guān)系作圖，其結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯瑔挝粫r間內(nèi)還原糖生成的量(反應(yīng)速率，v)對底物質(zhì)量濃度([S])呈典型的雙曲線關(guān)系，符合經(jīng)典的表征酶促反應(yīng)特征的米氏方程所繪制的曲線。

圖6 反應(yīng)速率與香/芭蕉根部球莖粉漿底物質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.6 Relationship between reaction velocity and substrate concentration

分別對還原糖的生成速率和底物質(zhì)量濃度取對數(shù)，以lnv-ln[S]作圖，其結(jié)果見圖7，圖7為一條直線，可認為香/芭蕉根部球莖粉漿，加入一定體積pH6.4檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調(diào)成粉漿，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶，在很短的一段時間內(nèi)，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解遵循一級反應(yīng)規(guī)律[8]，酶解的速率與香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度的對數(shù)關(guān)系遵循米氏方程規(guī)律，可用米氏方程對實驗數(shù)據(jù)進行擬合。

圖 7 lnv與 ln[S]關(guān)系圖Fig.7 Relationship between lnv and ln[S]

Michaelis-Menten方程提出酶促反應(yīng)按下列兩步進行：

即液態(tài)高溫α-淀粉酶(E)與香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖(S)首先結(jié)合成中間酶合產(chǎn)物(ES)，中間酶合產(chǎn)物分解生成產(chǎn)物還原糖(P)后，使液態(tài)高溫α-淀粉酶重新游離出來[9]。式中k1為酶合中間產(chǎn)物ES生成的反應(yīng)速率常數(shù)，k2和k3分別代表中間酶合產(chǎn)物ES分解為E+S和E+P的反應(yīng)速率常數(shù)，k4為E+P復(fù)合生成ES的反應(yīng)速率常數(shù)。反應(yīng)初期，沒有還原糖產(chǎn)物(P)或還原糖產(chǎn)物質(zhì)量濃度[P]很低，k4可忽略不計，故第二步反應(yīng)可認為是單向的。由質(zhì)量守恒定律可得到反應(yīng)動力學(xué)模型：

米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm是香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶促反應(yīng)中兩個重要動力學(xué)參數(shù)。Km=(k2+k3)/k1，相當于酶的活性部位一半被香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖占據(jù)時所需的底物質(zhì)量濃度；Vm=k3[Et]，表示高溫α-淀粉酶質(zhì)量濃度不變時，酶被底物飽和，反應(yīng)速度達到最大。

2.2.1 用Lineweaver-Buck (雙倒數(shù)做圖法)求解米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率

米氏常數(shù)Km和最大速率常數(shù)Vm，通常用米氏方程轉(zhuǎn)型后的Lineweaver-Buck求解[10]，將上式倒數(shù)后得如下方程：

式中的斜率=Km/Vm，縱截距=1/Vm。以1/v對1/[S]作圖，得到圖8所示的各對應(yīng)點，再用最小二乘法線性擬合，可得到直線方程1/v=39.519/[S]+1.373，即液態(tài)高溫α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖的米氏常數(shù)Vm=0.728mg/(mL·min)，Km=28.777mg/mL。米氏方程為：

方程的相關(guān)系數(shù)R=0.979，方程相關(guān)性顯著。

圖8 高溫α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球莖粉漿的Lineweaver-Buck圖Fig.8 Lineweaver-Buck plot of thermostable alpha-amylase-catalyzed hydrolysis of banana corm powder

2.2.2 用Wilkinson統(tǒng)計法求解米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率

Wilkinson統(tǒng)計法包括非線性二乘法求估算解和泰勒展開式求精校解[11]，計算過程分兩步，如表1、2所示。

式中：Vm0為最大反應(yīng)速率的估算解；Km0為米氏常數(shù)的估算解。

式中：b1、b2為Vm和Km計算過程中修正常數(shù)。

由此可求得精較解：

表1 WiIkinson法求估算解Table 1 Estimated resolution of Vm and Km by Wilkinson method

表2 Wilkinson 法求精校解Table 2 Accurate resolution of Vm and Km by Wilkinson method

2.2.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson 統(tǒng)計法的比較

表3 Lineweaver與 Wilkinson求解結(jié)果比較Table 3 Comparisons on Vm and Km obtained by Lineweaver and Wilkinson methods

由表3可以看出，Lineweaver-Buck法和Wilkinson統(tǒng)計法處理得到的Vm和Km值有一定的差別。其原因是用Lineweaver-Burk法作圖[12]，香/芭蕉根部球莖粉漿質(zhì)量濃度[S]應(yīng)在0.330～2.000Km時求解才準確，而香/芭蕉根部球莖粉漿濃度很低時，酶解速率很低，取倒數(shù)后，其對應(yīng)的點偏離擬合曲線較遠，將影響動力學(xué)參數(shù)Km和Vm的準確測定，即使采用最小二乘法進行線性回歸分析，也難于有效地消除它的影響。然而盡管如此，此法仍廣為采用。Wilkinson統(tǒng)計法被認為是計算結(jié)果較為可靠的方法，但計算過程冗長而復(fù)雜。分析比較后，本實驗采用Wilkinson統(tǒng)計法的求解結(jié)果[13-16]，即Vm為0.708mg/(mL·min)，Km為27.410mg/mL。

2.3 香/芭蕉根部球莖粉漿酶解條件優(yōu)化

根據(jù)液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖的反應(yīng)條件及影響因素，下述選擇A(溫度)、B(pH值)、C(底物質(zhì)量濃度)、D(加酶量)，以L9(34)正交表進行試驗，各組按照表中不同的條件水解40min，取0.5g樣液于25mL容量瓶，按1.4節(jié)方法測定水解液中還原糖含量，并以此作為考察香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解液化和糖化效果的指標，其正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗方案及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design arrangement and experimental results

由表4可知，影響香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖酶解主次因素順序為A＞B＞C＞D，即溫度＞pH值＞底物質(zhì)量濃度＞酶添加量。若不考慮交互作用，則液態(tài)高溫α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖較優(yōu)條件為A2B2C3D2，即酶解溫度85℃、pH6.4、底物質(zhì)量濃度30mg/mL、酶添加量0.064mL/g。利用較優(yōu)組合條件進行水解實驗，得到水解液中還原糖含量(DE值)為37.61%。

3 結(jié) 論

綜上所述，利用液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球莖粉漿，最佳水解工藝條件為粉漿酸度pH6.4、底物質(zhì)量濃度30mg/mL、酶添加量0.064mL/g、酶解溫度85℃。在該工藝條件下，香/芭蕉根部球莖粉漿中的多糖可溫和地水解，水解液中還原糖含量最高，DE值可達37.61%。且液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于香蕉根部球莖粉漿中的多糖，其酶解反應(yīng)遵循一級反應(yīng)規(guī)律，遵循Michaelis-Menten方程，米氏常數(shù)Km=27.41mg/mL，最大反應(yīng)速度Vm=0.708mg/(mL·min)。利用液態(tài)高溫α-淀粉酶水解香蕉根部球莖粉漿中的多糖，可實現(xiàn)原料的液化和糖化同步進行，簡化工藝過程，有利于燃料乙醇的生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本。

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Optimal Conditions and Kinetics of Enzymatic Hydrolysis of Banana Corm Powder

CHEN Wei，HUANG Guang-min*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The optimal conditions for the hydrolysis of banana corm powder with thermostable alpha-amylase were investigated by single-factor and orthogonal array design methods, and a kinetic analysis of the hydrolysis of banana corm powder was performed. Liquefaction temperature of 85 ℃, pH of 6.4, substrate concentration of 30 mg/mL and enzyme loading of 0.064 mL/g were found optimal, and a DE value of 37.61% was obtained under these conditions. TheVm andKm were determined to be 0.708 mg/ (mL·min) and 27.410 mg / mL, respectively.

banana root corm; thermostable alpha-amylase; kinetics

S668.1

A

1002-6630(2010)20-0260-06

2010-06-22

海南省教育廳高?？蒲许椖?Hj200710)；?？谑兄攸c科技項目(0000017)

陳偉(1985—)，男，碩士研究生，主要從事糖及碳水化合物研究。E-mail：chwhg@sina.com

*通信作者：黃廣民(1957—)，男，教授，主要從事糖及碳水化合物和生物質(zhì)能源研究。E-mail：hgmin886699@163.com