花生分離蛋白提取工藝優(yōu)化研究

矯麗媛，呂敬軍，陸豐升，于麗娜，楊慶利,*，孫 杰，畢 潔，張初署

(1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100；3.臨沂市農(nóng)業(yè)委員會，山東 臨沂 276000；4.沂水縣林業(yè)局，山東 沂水 276400)

花生分離蛋白提取工藝優(yōu)化研究

矯麗媛1,2，呂敬軍3，陸豐升4，于麗娜2，楊慶利2,*，孫 杰2，畢 潔2，張初署2

(1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100；3.臨沂市農(nóng)業(yè)委員會，山東 臨沂 276000；4.沂水縣林業(yè)局，山東 沂水 276400)

采用堿提酸沉方法從脫脂花生蛋白粉中提取花生分離蛋白，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化花生分離蛋白的提取條件。結(jié)果表明：浸提時間和堿液pH值對提取的花生分離蛋白純度都有顯著影響，且呈非線性關(guān)系，最佳提取工藝參數(shù)為浸提時間131min、浸提溫度50℃、堿液pH10、料液比1:12(g/mL)。在此條件下，花生分離蛋白的純度為95.05%、提取率71%。響應(yīng)面法對花生分離蛋白提取條件的優(yōu)化是可行的。

花生蛋白粉；花生分離蛋白；堿提酸沉；響應(yīng)面法

我國是花生生產(chǎn)大國，花生年產(chǎn)量居世界首位?；ㄉ诠糯环Q為“長生果”，經(jīng)常食用可養(yǎng)血補血、補脾潤肺、滋潤肌膚，可預(yù)防高血壓、動脈硬化和心血管等方面的疾病[1]。花生中的蛋白質(zhì)含量達20%～30%，僅次于大豆，花生也是一種重要的油料蛋白資源。在植物蛋白資源中，花生蛋白居第3位，占蛋白總量的1l%，是較理想的食用蛋白資源[2]?；ㄉ鞍资且环N營養(yǎng)價值較高的植物蛋白，它含有人體所需的8種必需氨基酸，而且谷氨酸、天門冬氨酸含量較高，與動物蛋白相近，且不含膽固醇，可消化性高，其消化系數(shù)達90%以上，與應(yīng)用較廣的大豆蛋白相比，花生蛋白不含脹氣因子，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較少。目前國際上花生蛋白產(chǎn)品根據(jù)蛋白質(zhì)的含量，主要分為花生蛋白粉(純度＜65%)、濃縮蛋白[3](純度65%～70%)、分離蛋白(純度85%～96%)，其中花生蛋白粉又分為全脂、半脫脂和脫脂花生蛋白粉[4]。花生分離蛋白制備方法主要包括堿提酸沉法[5-6]、超濾膜法[7]、超聲波提取法[8]及水酶法[9-10]。我國對花生蛋白產(chǎn)品的開發(fā)研究主要集中在：花生蛋白粉、花生蛋白飲料、花生蛋白煉乳、花生蛋白膜、花生多肽以及花生蛋白改性等方面[11-15]。

與世界較發(fā)達國家相比，我國雖然是花生生產(chǎn)大國，但是對花生蛋白的利用很有限，開發(fā)和利用花生蛋白資源，對于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)具有重要意義。此外，花生分離蛋白有很好的功能特性，氨基酸種類及含量非常豐富，對人體的蛋白補充和保健食品的開發(fā)都有重要的作用。堿溶酸沉技術(shù)制備的蛋白溶解性、起泡能力及泡沫穩(wěn)定性較好[16]、蛋白純度較高，既可作為食品的主要成分，又可作為食品的輔料廣泛用于食品中，同時在酶解制備花生多肽、短肽等功能性食品中可廣泛應(yīng)用。本實驗通過對花生蛋白粉的堿溶酸沉制備花生分離蛋白進行研究，以期獲得高純度的花生分離蛋白，對于花生分離蛋白的進一步研究利用提供相關(guān)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂花生蛋白粉(花生仁經(jīng)過篩選、脫除紅衣，采用低溫壓榨技術(shù)得到低溫壓榨的花生油和低變性的半脫脂餅，以半脫脂的花生餅為原料，采用浸出低溫脫溶生產(chǎn)工藝加工低變性脫脂花生粕，粉碎后過80目篩，篩分成為脫脂蛋白粉) 山東天申生物蛋白有限公司；95%乙醇、蒸餾水、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；DZ-2自動電位滴定裝置 上海大普儀器有限公司；2300自動定氮儀、Soxtec Avanti 2050自動索氏總脂肪分析系統(tǒng) 瑞典Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備工藝流程

其中酸沉淀花生蛋白條件：用0.1mol/L鹽酸溶液將兩次上清液滴定至花生蛋白等電點pH4.41[17]。

1.3.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

依次改變花生蛋白粉堿提酸沉淀的溫度、堿液pH值、堿提時間和堿提固液比，以花生蛋白純度和蛋白得率作為評價指標(biāo)進行研究和分析，并確定四因素三水平的最佳參數(shù)進行響應(yīng)面分析。

1.3.3 蛋白純度和蛋白得率的測定

蛋白純度：凱氏定氮法。

1.3.4 原料組分含量的測定

蛋白含量測定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》(凱氏定氮法)；脂肪含量測定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》(索氏抽提法)；水分含量測定：GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》(105℃恒重法)；灰分含量測定：GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》(550℃灼燒法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生蛋白粉的主要成分

由表1可知，花生蛋白粉中粗蛋白含量很高，點總成分的47.72%。

表1 花生蛋白粉的主要成分Table 1 Major components of peanut protein powder

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 浸提溫度對花生分離蛋白制備的影響

圖1 浸提溫度對花生分離蛋白制備的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on purity and yield of peanut protein isolate

用堿液浸提花生蛋白粉的過程中控制體系pH9、浸提時間90min、料液比1:10(g/mL)，設(shè)置不同的溫度，但是溫度不宜過高，以免使蛋白變性，研究浸提溫度對花生分離蛋白制備的影響(圖1)。從圖1可知，隨著溫度的升高，蛋白純度逐漸提高，40℃以上蛋白純度趨于不變；蛋白提取率隨溫度升高，先升高再降低，40℃時蛋白提取率最高。綜合考慮兩評價指標(biāo)確定溫度為40、45、50℃繼續(xù)做響應(yīng)面分析以確定最佳的浸提溫度。

2.2.2 堿液pH值對花生分離蛋白制備的影響

圖2 堿液pH值對花生分離蛋白制備的影響Fig.2 Effect of alkali extraction pH on purity and yield of peanut protein isolate

堿液浸提花生蛋白粉過程中控制體系的溫度40℃、料液比1:10(g/mL)、浸提時間90min，設(shè)置不同pH值的堿液。實驗前測得實驗用花生蛋白粉溶于水顯酸性，蛋白粉溶于pH值小于10.5的堿液時，顯弱堿性或中性，不會使蛋白變性。堿液pH值對花生分離蛋白制備的影響結(jié)果見圖2?；ㄉ鞍字饕煞质腔ㄉ虻鞍缀桶榛ㄉ虻鞍?，還有10%左右的清蛋白。全部的球蛋白和清蛋白都可溶于稀堿溶液中，蛋白質(zhì)溶解度隨pH值升高而增大，蛋白質(zhì)溶出增多。從圖2可知，隨著堿液pH值增加，蛋白純度及提取率都呈增加的趨勢，其中pH10時蛋白提取率最高，而蛋白含量在pH9時趨于穩(wěn)定。綜合考慮兩評價指標(biāo)的最佳pH值，選取pH9、9.5、10繼續(xù)做響應(yīng)面分析以確定最佳的堿液pH值。

2.2.3 浸提時間對花生分離蛋白制備的影響

圖3 浸提時間對花生分離蛋白制備的影響Fig.3 Effect of extraction time on purity and yield of peanut protein isolate

堿液浸提花生蛋白粉過程中控制體系的溫度40℃、料液比1:10(g/mL)、堿液pH9.5，設(shè)置不同的浸提時間，研究浸提時間對花生分離蛋白制備的影響，結(jié)果見圖3。如圖3所示，蛋白純度隨著時間的增加而增加，90min以后增加幅度減緩，而蛋白提取率隨時間增加先提高再下降。這個過程可能是浸提時間延長，蛋白的溶出增加，一定時間后，蛋白的溶出達到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進一步延長浸提時間，可能因為微生物生長等因素使蛋白質(zhì)變性從而使提取率降低。綜合評價兩指標(biāo)的最佳浸提時間段，選取90、120、150min繼續(xù)做響應(yīng)面分析以確定最佳的浸提時間。

2.2.4 料液比對花生分離蛋白制備的影響

圖4 料液比對花生分離蛋白制備的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on purity and yield of peanut protein isolate

堿液浸提花生蛋白粉過程中控制體系的溫度40℃、浸提時間90min、堿液pH9.5，設(shè)置不同的料液比，研究料液比對花生分離蛋白制備的影響，結(jié)果見圖4。如圖4所示，蛋白純度隨堿液量的增加變化不大，而蛋白提取率則隨堿液量增加而提高。因為單位堿液只能溶解一定量的蛋白，該單因素試驗選用的堿液量不能使花生蛋白充分溶解或者花生蛋白剛剛完全溶解，所以，在不同的料液比條件下，蛋白純度趨于平衡。而隨堿液量增加，蛋白的溶解量增加，從而使得蛋白的提取率增加。從圖4可以看出，在料液比1:11(g/mL)左右即為蛋白溶解充分的點，所以選取料液比1:10、1:11、1:12(g/mL)繼續(xù)做響應(yīng)面分析以確定最佳的料液比。

2.3 花生分離蛋白提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，考察浸提時間(X1)、溫度(X2)、堿液pH值(X3)和料液比(X4)對蛋白純度(Y)的影響，試驗因素及水平見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。試驗設(shè)計與分析采用Design-Expert軟件。

表2 中心組合試驗因素水平編碼表Table 2 Factors and levels in the response surface design

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，對自變量編碼X1、X2、X3和X4進行回歸分析，得二次多項回歸方程為：

表3 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

通過Design-Expert軟件進行方差分析來驗證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，結(jié)果見表4。

由方差分析可以看出，模型P值遠小于0.01，表示模型方程極顯著，模型失擬項不顯著，模型選擇適合。變異系數(shù)反映模型的置信度，變異系數(shù)越低，模型的置信度越好；本試驗的變異系數(shù)是1.07%，說明模型方程能很好的反應(yīng)真實的實驗值。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同浸提條件下，花生蛋白純度的變化情況。由表4的P值可以知道，方程中X1、X2、X3、X12對Y的影響顯著，表明試驗因素對響應(yīng)值的影響并非呈線性關(guān)系。通過直接比較方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷因素影響的主次性。對提取分離蛋白的純度影響的大小依次是浸提時間、堿液pH值、溫度、料液比，即浸提時間對分離蛋白的提取影響最顯著。

RSM的圖形是特定的響應(yīng)值Y對應(yīng)因素X1、X2、X3、X4值構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，從所得響應(yīng)面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用。從圖5可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系。

表4 模型的ANOVA分析結(jié)果Table 4 Variance analysis (ANOVA) for the fitted quadratic regression model

圖5 雙因素對蛋白質(zhì)純度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots demonstrating the pairwise interactive effects of four extraction conditions on purity and yield of peanut protein isolate

圖5a～f直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。比較6組圖可知：浸提時間對蛋白純度的影響最為顯著，表現(xiàn)曲線較陡；而堿液pH值、浸提溫度、料液比次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

2.3.2 提取條件的優(yōu)化及驗證

進一步用Design-Expert軟件對模型進行典型性分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經(jīng)分析得，在X1=130.77min、X2=50℃、X3=pH10、X4=1:12(g/mL)，即浸提時間130.77min、溫度50℃、堿液pH 10、料液比1:12(g/mL)得到的理論最大值是96.32%。

為了考慮驗證實驗的可行性，采用得到的最佳提取條件進行花生分離蛋白的提取實驗，同時考慮操作和生產(chǎn)的便利性，將提取條件修正為浸提時間X1=131min，其他條件不變，3次平行實驗得到的蛋白純度平均為95.05%，與理論值相差1.27%。此條件下的提取率達到了71%。因此響應(yīng)面法對花生分離蛋白提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的花生分離蛋白提取條件具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上進行四因素三水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化提取花生分離蛋白的工藝條件，響應(yīng)面試驗分析得出：在提取時間90～150min、提取溫度40～50℃、堿液pH9～10、料液比1:10～1:12(g/mL)的范圍內(nèi)，各因素對提取分離蛋白的純度影響的大小依次是浸提時間、堿液pH值、溫度、料液比；提取花生分離蛋白最佳提取工藝參數(shù)為浸提時間131min、溫度50℃、堿液pH值10、料液比1:12(g/mL)，此條件下花生分離蛋白的純度為95.05%，提取率達到71%。

[1] ALLEN L H. Priority areas for research on the intake, composition and health effects of tree nuts and peanuts[J]. J Nutr, 2008, 138(9): 1763S-1765S.

[2] RAMACHANDRAN S, SINGH S K, LARROCHE C, et al. Oil cakes and their biotechnological applications: a review[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(10): 2000-2009.

[3] YU Jianmei, AHMEDNA M, GOKTEPE I. Peanut protein concentrate:production and functional properties as affected processing[J]. Food Chemistry, 2007, 103(1): 1121-1129.

[4] 周雪松, 趙謀明. 我國花生食品產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J]. 食品與發(fā)酵行業(yè), 2004, 30(6): 84-88.

[5] 張寒俊. 堿溶酸沉法制備雙低菜籽分離蛋白的工藝探討[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2005(5): 40-43.

[6] 李明妹, 姚開, 賈冬英. 堿提酸沉法制備花生分離蛋白的優(yōu)化條件[J]. 中國油脂, 2004, 29(11): 21-23.

[7] 劉大川, 楊國燕, 翁利榮. 超濾膜法制備大豆分離蛋白工藝研究[J].中國油脂, 2003, 28(11): 30-31.

[8] 熊柳, 孫高飛, 王建華, 等. 花生分離蛋白的超聲波制取工藝[J]. 中國油脂, 2009, 34(2): 20-23.

[9] 楊波, 楊光, 張靜. 水酶法提取花生蛋白工藝的研究[J]. 食品科學(xué),2006, 27(11): 253-256.

[10] 王瑛瑤, 王璋. 水酶法從花生中提取蛋白質(zhì)與油: 堿提工藝研究[J].食品科技, 2002(7): 6-8.

[11] 吳海文, 王強, 周素梅. 花生蛋白及其功能性研究進展[J]. 中國油脂,2007(9): 7-11.

[12] 劉陽, 邢福國. 花生蛋白的開發(fā)與利用現(xiàn)狀[J]. 食品科技, 2008, 33(12): 173-176.

[13] 劉傳富, 張兆靜. 花生蛋白及其在食品中的應(yīng)用[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(1): 24-25.

[14] HWANG Jeanyu, SHUE Yeongshin, CHANG Hungmin. Antioxidative activity of roasted and defatted peanut kernels[J]. Food Research International, 2001, 34: 639-647.

[15] CLEMENTE A. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition[J].Trends Food Sci Technol, 2000, 11: 254-262.

[16] 吳海文, 王強, 馬鐵錚. 不同制備方法對花生蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2009, 25(4): 304-308.

[17] 齊向春, 齊志同. 花生蛋白制備工藝研究[J]. 中國油脂, 2008, 33(4):22-24.

Optimization of the Extraction of Peanut Protein Isolate

JIAO Li-yuan1,2，LJing-jun3，LU Feng-sheng4，YU Li-na2，YANG Qing-li2,*，SUN Jie2，BI Jie2，ZHANG Chu-shu2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, China；
2. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China；3. Committee on Agriculture of Linyi, Linyi 276000, China；4. County Forestry Bureau of Yishui, Yishui 276400, China)

Alkali extraction followed by acid precipitation was used to extract peanut protein isolate from defatted peanut powder. The extraction procedure was optimized by response surface methodology (RMS) on the basis of single factor experiments. Extraction time and pH exhibited a significant nonlinear effect on the purity of peanut protein isolate. The optimal extraction conditions were determined to be: extraction time, 131 min; extraction temperature, 50 ℃; alkali extraction pH, 10; and material/liquid ratio, 1:12. The purity and yield of peanut protein isolate were 95.05% and 71%, respectively, under the optimized extraction conditions.

peanut protein powder；peanut protein isolate；alkali extraction followed by acid precipitation；response surface methodologymethodology

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0196-06

2010-06-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD97B04)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(nycytx-19)；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目(09-1-1-84-nsh)

矯麗媛(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為生物化工。E-mail：jiaoliyuan0470@163.com

*通信作者：楊慶利(1977—)，男，助理研究員，博士，研究方向為花生綜合利用與花生功能食品開發(fā)。E-mail：rice407@163.com