大孔吸附樹脂分離純化杭白菊黃酮及其成分鑒定

楊立剛，孫桂菊，付為琳，黃 楠，王少康

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009）

大孔吸附樹脂分離純化杭白菊黃酮及其成分鑒定

楊立剛，孫桂菊*，付為琳，黃 楠，王少康

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009）

目的:研究AB－8大孔吸附樹脂分離純化菊花總黃酮提取物工藝，并對其主要成分進行鑒定，為進一步研究其藥理作用提供參考。方法:采用動態(tài)實驗和靜態(tài)實驗考察AB－8大孔吸附樹脂對菊花總黃酮的分離純化效果和影響因素，運用LC－MS/MS鑒定菊花黃酮主要成分。結(jié)果:AB－8大孔吸附樹脂可以有效地分離純化粗提物中的菊花總黃酮成分。優(yōu)化的純化條件是上樣量與柱體積之比約為1∶10，30%乙醇洗脫，獲得純度為84.5%的產(chǎn)物。鑒定出黃酮中含有木犀草素－7－葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素、芹菜素－7－葡萄糖苷。結(jié)論:AB－8大孔吸附樹脂法可用于分離純化菊花黃酮，其中含有菊花HPLC指紋圖譜的主要成分。

菊花，總黃酮，分離純化，大孔吸附樹脂，成分鑒定

菊花（Chrysanthemum Morifolium Ramat）為菊科多年生草本植物，是我國具有食用和藥用價值的常用花卉之一，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用［1］。菊花的主要成分為黃酮類、揮發(fā)油及氨基酸、微量元素等，黃酮類化合物是菊花的主要功效成分之一。因為菊花品種不同、產(chǎn)地不同、甚至采摘期的不同，菊花黃酮中的主要成分、含量都有差異［2］。木犀草素－7－葡萄糖苷（luteolin－7－glucoside）、芹菜素－7－葡萄糖苷（apigenin－7－glucoside）、木犀草素（luteolin）等成分在菊花中含量相對較高，被用作菊花HPLC指紋圖譜中的主要成分［3］。大孔吸附樹脂層析（macroporous adsorption resin chromatography，MARC）用于中草藥有效成分的分析，效果較好，其特點是吸附容量大、再生簡單，效果可靠，尤其適用于黃酮類、皂苷類等成分的分離純化［4－6］。本實驗采用微波法提取菊花中黃酮成分，考察了AB－8大孔吸附樹脂分離純化菊花黃酮的工藝條件與參數(shù)，并結(jié)合 HPLC－MS和MS－MS技術(shù)分析鑒定其主要成分，為進一步研究其構(gòu)效關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花 干燥，江蘇省射陽縣洋馬菊花基地;蘆丁

中國藥品生物制品檢定所;其他試劑 均為分析純。

722型分光光度計 上海第三分析儀器廠; AB－8大孔吸附樹脂 上海摩速公司;1100 LC/MS 1949A高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備菊花黃酮粗提物 本實驗室自行提取。

菊花→粉碎→加提取液（物料比1∶20，乙醇濃度60%）→微波提?。?00W，提取時間120s）→提取液→離心過濾→減壓蒸餾揮去乙醇→濃縮液

1.2.2 AB－8大孔吸附樹脂的預(yù)處理 用95%的乙醇浸泡樹脂過夜并洗滌，至洗滌液與5倍體積的水混合不產(chǎn)生渾濁，保持澄清為止。然后用蒸餾水洗滌，直到乙醇被完全洗凈，備用。

1.2.3 總黃酮的測定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 黃酮濃度的測定方法采用分光光度法（中國藥典2000年版一部附錄BV）于510nm波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:

樣品的測定:將適量樣品液用蒸餾水定容至100m L，搖勻，取一定量于25m L容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的顯色方法顯色，測定吸光度，代入回歸方程計算出黃酮含量。

1.2.4 AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮的靜態(tài)吸附特性研究

1.2.4.1 靜態(tài)吸附率測定及吸附時間曲線繪制 取2g處理好的樹脂，加入10m L菊花黃酮粗提液，振蕩吸附24h（振蕩頻率120次/m in），分別測定吸附前原液和吸附后的總黃酮含量，得到被吸附的總黃酮含量。按下式計算靜態(tài)吸附率:Q=（C0－Cr）×V/W。式中:Q為吸附率，mg/g;C0初始濃度，mg/m L;Cr剩余濃度，mg/m L;V溶液體積，m L;W樹脂質(zhì)量，g。按上述方法加入樣品，振蕩吸附，并分別在6、9、12、24h測定吸附率，以樣品中黃酮被吸附百分率表示。

1.2.4.2 靜態(tài)解吸附性測定及解吸附體積曲線繪制

分別取兩份2g樹脂，各加入10m L粗提物樣品振蕩吸附，測定其吸附的總黃酮含量（樣液所含總黃酮量－剩余未吸附總黃酮的量），分別用95%和75%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液測定其中總黃酮含量，計算解吸附率（洗脫下來的黃酮量/吸附的黃酮量）。另取5m L樣液（黃酮含量13.71mg），用2g樹脂振蕩吸附，洗掉樹脂表面未被吸附的黃酮，用75%乙醇洗脫，每10m L洗脫液收集于一根比色管中，共收集8管，共計80m L。測定每管中所含黃酮濃度，繪制解吸附體積曲線。

1.2.5 AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮的動態(tài)解吸附特性 將處理好的樹脂約20g濕法裝填一根20× 2.5cm的層析柱，將黃酮粗提物樣品10m L（含黃酮29.72mg）上柱，用蒸餾水淋洗至洗出液無色，75%乙醇洗脫，流速約為4m L/m in，每25m L集中于一根比色管，共收集10管共計250m L洗脫液。依次測定每管中黃酮濃度求出每管中黃酮含量，計算黃酮得率（洗脫液中黃酮含量/加入樣品中黃酮的含量）。以每管的黃酮濃度繪制動態(tài)解吸附體積曲線。

1.2.6 上樣量對純化效果的影響 濕法裝5根30× 2.5cm的層析柱，分別上樣5、10、20、30、40m L，用蒸餾水淋洗至洗出液無色，以75%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定黃酮濃度，計算回收率，烘干，稱重，計算純度。

1.2.7 靜置吸附時間對純化效果的影響 濕法裝4根20×2.5cm的層析柱，上樣10m L，分別在靜置吸附0、15、30、60m in后，蒸餾水淋洗，以75%乙醇洗脫，收集洗脫液測定黃酮濃度，計算黃酮回收率，烘干，稱重，計算純度。

1.2.8 洗脫劑濃度對純化效果的影響 濕法裝5根20×2.5cm的層析柱，各上樣10m L，蒸餾水淋洗至無色，分別以90%、75%、60%、45%、30%的乙醇洗脫。收集洗脫液測定黃酮濃度，計算黃酮回收率，烘干，稱重，計算純度。

1.2.9 樣液制備 收集洗脫液干燥成粉末，稱取一定量用甲醇和水溶解定容，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得待測液。

1.2.10 高效液相色譜條件 色譜柱:Aglient Zorbax SB C18色譜柱 （4.6mm ×150mm，5μm）;流速0.3m L/m in;檢測波長 348nm;柱溫 25℃;進樣量20μL;流動相A:10%乙腈，B:0.1%甲酸水溶液，采用梯度洗脫［7］。

1.2.11 LC－MS檢測質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子化電離源（ESI），正離子監(jiān)測（即ESI+）;掃描方式:離子檢測（SRM）;霧化氣、鞘氣為高純氮氣;霧化器流速1.5m L/m in，檢測電壓1.5kV，掃描范圍100～1000m/z，離子源溫度320℃，色譜柱流出組分進入質(zhì)譜儀流速為10μL/m in。記錄總離子流（TLC）色譜圖，對不同分子量的峰進行掃描。

1.2.12 二級質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源，噴霧電壓4000V，離子源溫度110℃，碰撞氣壓力1.5kV，碰撞電壓50V，毛細(xì)管溫度305℃，采用四極桿質(zhì)量分析器，正離子方式檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮的靜態(tài)吸附及解吸特性

2.1.1 靜態(tài)吸附實驗 經(jīng)計算AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮的飽和吸附量約為15.78mg/g樹脂，吸附時間曲線見圖1。

圖1 吸附時間對靜態(tài)吸附率的影響

2.1.2 靜態(tài)解吸附實驗 在靜態(tài)條件下，75%和 95%乙醇均可獲得較高的解吸附率，分別為89.5%和91.8%，75%乙醇解吸附體積曲線見圖2。

圖2 解吸附體積曲線

2.2 AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮的動態(tài)吸附及解吸特性

動態(tài)解吸附曲線見圖3。

圖3 動態(tài)解吸附曲線

2.3 上樣量對純化效果的影響

上樣量對純化效果的影響見圖4。當(dāng)上樣量過小時部分雜質(zhì)被吸附的機會增大，未能達(dá)到最佳分離效果，而上樣量過大時，樹脂吸附飽和，樣液中黃酮、水和大極性雜質(zhì)一同流出，導(dǎo)致提取率低。確定上樣量與柱體積之比約為1∶10。

圖4 上樣量對純化效果的影響

2.4 靜置吸附時間對純化效果的影響

靜置吸附時間對純化效果的影響見圖5。從結(jié)果上看，吸附時間在0～30m in范圍內(nèi)回收率基本一致。

圖5 靜置吸附時間對純化效果的影響

2.5 洗脫劑濃度對純化效果的影響

采用不同濃度乙醇盡可能完全洗脫，洗脫劑濃度對純化效果的影響見圖6?；厥章孰S著乙醇濃度降低略呈降低趨勢，純度隨乙醇濃度降低呈增加趨勢，洗脫液體積隨著乙醇濃度的降低呈增加趨勢。這可能與菊花中黃酮類化合物的組成有關(guān)。菊花黃酮類化合物中有相當(dāng)一部分與糖結(jié)合形成黃酮苷，以苷的形式存在，而另有一部分以游離態(tài)也就是苷元的形式存在;苷元難溶或不溶于水，易溶于有機溶劑，黃酮苷類則易溶于水等強極性溶劑，黃酮類化合物在植物中以游離苷元形式存在較少［8－9］。當(dāng)洗脫劑乙醇濃度較低時，黃酮苷類較易洗脫，而苷元和醇溶性雜質(zhì)難以洗脫，所以純度較高。用高濃度乙醇洗脫時，醇溶性雜質(zhì)同時也被洗脫下來。但乙醇濃度太低會使洗脫時間延長，洗脫液體積增大，洗脫體積曲線拖尾。

圖6 乙醇濃度對純化效果的影響

2.6 LC－MS聯(lián)用結(jié)果分析

由液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖及離子流掃描圖，對可能含有的物質(zhì)的質(zhì)荷比（m/z）離子流進行搜索，即用m/z分別為448（木犀草素－7－葡萄糖苷）、286（木犀草素）、270（芹菜素）、432（芹菜素－7－葡萄糖苷）、302（槲皮素）、300（香葉木素）、284（金合歡素）等加氫［M+H］+進行搜索，發(fā)現(xiàn)有明顯的433和287的正離子峰，說明含有m/z為432和286的物質(zhì)，因此考慮還可能含有芹菜素－7－葡萄糖苷（m/z 432）和芹菜素（m/z 270），需要做MS/MS進一步分析其結(jié)構(gòu)才可確定［10－11］。另外，雖然可以看出含有m/z為300和284的物質(zhì)，但根據(jù)結(jié)構(gòu)和出峰時間推斷不是香葉木素和金合歡素，可能是分子量相同的其他物質(zhì)。通過一級質(zhì)譜對木犀草素－7－葡萄糖苷相應(yīng)的離子流進行分析，見圖7，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的斷裂碎片結(jié)構(gòu)是一致的，從結(jié)構(gòu)方面進一步證實確實含木犀草素－7－葡萄糖苷。

圖7 樣品中木犀草素－7－葡萄糖苷的一級質(zhì)譜圖

2.7 MS－MS分析結(jié)果

對樣品中木犀草素－7－葡萄糖苷進行二級質(zhì)譜分析，正、負(fù)離子分別掃描，結(jié)果見圖8。由圖可以看出，其斷裂出m/z為286的結(jié)構(gòu)片段，正是由于糖苷鍵斷裂，木犀草素－7－葡萄糖苷斷裂為木犀草素這一結(jié)構(gòu)。

對樣品中m/z為432的物質(zhì)進行二級質(zhì)譜分析，正、負(fù)離子分別掃描，結(jié)果見圖9。由圖可以看出，其斷裂出m/z為269的結(jié)構(gòu)片段，正是由于糖苷鍵斷裂，芹菜素－7－葡萄糖苷斷裂為木犀草素這一結(jié)構(gòu)，其他碎片結(jié)構(gòu)分子量與文獻報道此質(zhì)譜條件下的碎片相一致［12］。

圖8 樣品中木犀草素－7－葡萄糖苷二級質(zhì)譜圖

圖9 樣品中m/z為432的物質(zhì)二級質(zhì)譜圖

對樣品中m/z為286的物質(zhì)進行二級質(zhì)譜分析，正、負(fù)離子分別掃描，結(jié)果見圖10。由圖可以看出，在負(fù)離子條件下，撞擊可斷裂出m/z為151、133、107等結(jié)構(gòu)碎片，與文獻報道的木犀草素在此質(zhì)譜條件下的斷裂片段相吻合，推斷樣品中含有木犀草素［13］。

圖10 樣品中m/z為286的物質(zhì)二級質(zhì)譜圖

對樣品中m/z為270的物質(zhì)進行二級質(zhì)譜分析，正、負(fù)離子分別掃描，結(jié)果見圖11。由圖可以看出，在正離子條件下，撞擊可斷裂出m/z為153、119等碎片，負(fù)離子條件下，撞擊可斷裂出m/z為151、107等結(jié)構(gòu)碎片，與其他國外文獻報道芹菜素在此質(zhì)譜條件下斷裂的碎片相一致，推斷此物質(zhì)是芹菜素特征性的結(jié)構(gòu)碎片，推斷樣品中可能含有芹菜素［13］。

圖11 樣品中m/z為270的物質(zhì)二級質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

黃酮類化合物具有多酚等結(jié)構(gòu)，不同化合物極性強弱不同，依靠大孔吸附樹脂與其之間的范德華力進行吸附，可取得良好分離純化效果［14］。在上樣量與柱體積之比約為1∶10，30%乙醇進行洗脫條件下，經(jīng)過純化過程所得到的產(chǎn)物中黃酮純度已達(dá)到84.5%，證實AB－8大孔吸附樹脂對菊花黃酮能起到較好的分離純化作用，可以使菊花中黃酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)得到很好的分離。運用LC－MS/MS技術(shù)鑒定出黃酮中含有木犀草素－7－葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素、芹菜素－7－葡萄糖苷等菊花HPLC指紋圖譜的主要成分，為今后進一步研究菊花黃酮的藥理作用提供了參考。

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Separation，purification and identification of flavonoids from chrysanthemum w ith AB－8 macroporous absorption resin

YANG Li－gang，SUN Gui－ju*，F(xiàn)U W ei－lin，HUANG Nan，WANG Shao－kang

（College of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China）

Ob jective:To study the separation and purification of flavonoids from the crude flavonoids extraction w ith AB－8 mac roporous absorp tion resin and identify the flavonoids.Method:With the purity of flavonoids as index，effects and affective factors of separation and purification of flavonoids were stud ied by the static and dynam ic absorp tion and desorp tion tests w ith AB－8 macroporous absorp tion resin.The flavonoids were identified by LC－MS/MS.Results:The AB－8 resin purified flavonoids extraction effectively.The op timum conditions were:10m L sam p le added on the column，using 30%ethanol as eluting menstruum.The flavonoids purity was 84.5%.The com position of flavones was identified as luteolin－7－g lucoside，luteolin，ap igenin and ap igenin－7－g lucoside. Conc lusion:The AB－8 resin showed good purification capab ility of total flavonoids from chrysanthemum and the flavonoids were identified as HPLC fingerp rint of flavonoids.

chrysanthemum;total flavonoids;separation and purification;macroporous adsorp tion resin; identification

TS201.2

A

1002－0306（2010）08－0125－04

2009－09－16 *通訊聯(lián)系人

楊立剛（1976－），男，碩士，講師，研究方向:天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

江蘇省科技攻關(guān)計劃資助項目（BE2006318）。