運動和PI3K阻斷劑對大鼠骨骼肌mTOR及下游信號的作用研究

曾凡星，朱 晗，趙 華，歐陽芡

（1.北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院，北京100084；2.天水師范學(xué)院體育學(xué)院，甘肅 天水741001）

運動和PI3K阻斷劑對大鼠骨骼肌mTOR及下游信號的作用研究

曾凡星1，朱 晗1，趙 華2，歐陽芡1

（1.北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院，北京100084；2.天水師范學(xué)院體育學(xué)院，甘肅 天水741001）

目的：通過觀察一周注射PI3K阻斷劑和跑臺運動對mTOR及其下游信號的影響，深入探討PI3K對運動骨骼肌蛋白合成信號的機理。方法：8周齡雄性SD鼠在適應(yīng)性訓(xùn)練后分為四組：安靜組（S）、阻斷劑組（SL）、運動組（E）、運動＋阻斷劑組（EL），每組6只。運動方式為跑臺運動（坡度為10%，跑速20m／min，60min），每天一次，共7天。腹腔注射外源性LY294002。用Western Blotting法檢測腓腸肌MHC、mTOR（Ser2448）、p70S6K（Thr389）和4EBP1（Thr37／46）的磷酸化表達。結(jié)果：在一周后，LY294002明顯抑制MHC，運動有促進的趨勢，并減弱LY294002對MHC的抑制效應(yīng)。LY294002顯著抑制 mTOR（Ser2448）、p70S6K（Thr 389）和4EBP1（Thr 37／46）的磷酸化表達，而運動明顯增強其表達。外源性LY294002和運動因素間存在交互效應(yīng)，LY294002減弱運動對此通路的促進效應(yīng)。結(jié)論：1）一周外源性PI3K阻斷劑注射明顯抑制mTOR及下游信號，并能顯著抑制運動所引起的蛋白促合成效應(yīng)。2）mTOR的兩個下游信號對運動均較敏感，但4EBP1對PI3K阻斷劑的反應(yīng)較為遲鈍。

PI3K；LY294002；mTOR通路；骨骼肌肥大；運動

骨骼肌蛋白質(zhì)代謝是機體在運動訓(xùn)練適應(yīng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前對這種適應(yīng)機制的研究主要關(guān)注于骨骼肌內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。研究證實，運動促進骨骼肌肥大過程的主要合成信號通路為PI3K／Akt／mTOR通路［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，運動可以有效地增強mTOR及下游信號的磷酸化反應(yīng)。但使用在體阻斷骨骼肌PI3K信號結(jié)合運動研究mTOR及下游信號鮮見。以mTOR及其下游信號（p70S6K和4EBP1）為著眼點，觀察該通路在注射一周PI3K阻斷劑的耐力運動模型中的變化特征及與蛋白合成的關(guān)系，研究PI3K對運動骨骼肌蛋白合成的調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

健康雄性、SPF級8周齡SD大鼠，體重（177.8±5.4）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。國家標準嚙齒類動物飼料，分籠飼養(yǎng)，4只／籠。自由飲食，溫度維持在22℃～24℃，相對濕度50%～65%。晝夜節(jié)律人工控制光照（光照時間為8∶00～20∶00）。

在適應(yīng)性訓(xùn)練后，動物經(jīng)體重分層后隨機分為四組：安靜組（S）、阻斷劑組（SL）、運動組（E）、運動 ＋阻斷劑組（EL），每組6只。各組體重在正式分組前無組間差異。

1.2 動物運動方案

正式訓(xùn)練前，動物在跑臺上進行4天的適應(yīng)性訓(xùn)練，之后休息3天。適應(yīng)性訓(xùn)練方案見表1。

表1 動物適應(yīng)性訓(xùn)練方案

正式實驗共7天，安靜組常規(guī)飼養(yǎng)，運動組進行7天的運動，運動方案為上坡跑（坡度為10%）、速度20m／min，每天訓(xùn)練 60min（根據(jù) Bedford經(jīng)驗公式，相當(dāng)于 75%VO2max）［2］。運動時間為每日上午 8∶00～9∶00。

1.3 LY294002注射方案

LY294002（購自Cayman Chemical Company公司，產(chǎn)品批次為0400072－24）為PI3K的特異性阻斷劑［3］，采用大鼠腹腔注射。每天運動后即刻，SL和 EL組在大鼠腹腔注射LY294002。其他組注射同等劑量的安慰劑。具體劑量安排如表2。

表2 LY294002注射劑量安排表

1.4 測試樣本采集與處理

取材前禁水禁食12h，以0.3mL／100g為劑量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹主動脈取血，然后速取后肢腓腸肌。接著用生理鹽水將其洗凈，剔除肌腱及筋膜組織，用干凈濾紙將其吸干，用錫紙將其包裹后迅速投入液氮，而后置于－80℃冰箱保存待測。

1.5 指標測試方法

1.5.1 提取蛋白 勻漿緩沖液的配制：取 RIPA裂解液100mL，分別加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑（Roche公司）各10片，最后取100mM PMSF 1000μL加入。PMSF于臨用前數(shù)分鐘加入。于勻漿前新鮮配制。

用精密天平稱取腓腸肌120mg，用眼科剪迅速剪碎，按1∶10比例向玻璃勻漿器中加入預(yù)冷的裂解液，再在冰水浴中進行勻漿，直至沒有肉眼可視的懸浮物。將組織勻漿液倒入1.5mL EP管中，靜置 10min。于4℃，12 000g，10min離心，取上清液，分裝后保存于－80℃待測。

1.5.2 蛋白濃度測試法（Bradford） 配制Bradford工作液：按照《精編分子生物學(xué)實驗指南》配制［4］。標準曲線制備：用1 mg／mL BSA標準蛋白分配制0、10、20、40、60、80、100ug梯度。加入5mL Bradford工作液，用旋渦混勻器混勻后靜置5min。測A595nm。制作標準曲線后，再分批次測試樣品濃度。

1.5.3 Western Blot測試 Tris-甘氨酸電泳緩沖液、上樣緩沖液、電轉(zhuǎn)液、堆積膠和分離膠的配制均參照《Current protocols in protein science》實驗方法［5］，TBS、TBST、封閉液按照Cell Signaling抗體說明書的要求配制。

取100μg總蛋白配制成上樣體系，置95℃沸水中5min，再于4℃中冷卻，上樣前以3 000rpm離心5min。配制分離膠6%（MHC、mTOR）、8%（Actin、p70S6K）、10%（β-actin）或16.5%（4EBP1）以及5%濃縮膠。濃縮膠用80V恒壓，分離膠換120V恒壓電泳。再用半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，以恒壓20V半干轉(zhuǎn)。封閉90min后用加入一抗，不同抗體稀釋比例分別為 β-actin（購自 Santa Cruz公司）為1：500，F(xiàn)astMyosin Skeletal Heavy chain antibody［MY-32］（Abcam 公 司）為1∶2000，Phospho-mTOR（Ser2448）（Cell Signaling公司）為1∶800，Phospho-p70S6K（Thr389）（Cell Signaling公 司）為1∶1200，Phospho-4E-BP1（Thr37／46）（Cell Signaling公司）為1∶800，然后4℃孵育過夜。次日晨用TBST洗膜后用不同濃度二抗室溫孵育60min。用ECL發(fā)光試劑與膜在暗室中反應(yīng)、曝光。曝光底片用凝膠成像系統(tǒng)的透光拍照，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析。將每個條帶與相應(yīng)樣品的β-actin條帶光密度值進行比較，計算出目的條帶的相對含量值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

對實驗檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)處理運用SPSS 13.0軟件。組間比較采用雙因素方差分析（UNIANOVA）和單因素方差分析（One-Way ANOVA）。對觀測點的組間多重比較（Post Hoc）采用LSD或Tamhane’s T2方法分析。顯著性檢驗水平以P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

在一周的實驗后，分別測得各個實驗動物組腓腸肌的MHC和mTOR及其下游信號表達值，具體實驗結(jié)果見表3、圖1。

表3 LY294002和運動干預(yù)下大鼠MHC和m TOR及下游信號表達值（相對含量）

在一周后，LY294002（F＝10.305，P＜0.01）明顯抑制MHC，運動（F＝2.388，P＞0.05）有促進的趨勢，并減弱LY294002對MHC的抑制效應(yīng)。LY294002顯著抑制mTOR（Ser2448）（F＝25.342，P＜0.01）、p70S6K（Thr389）（F＝38.083，P＜0.01）和 4EBP1（Thr37／46）（F＝3.455，P＜0.05）的磷酸化表達，而運動明顯增強表達。外源性LY294002和運動因素間存在交互效應(yīng)，運動減弱LY294002對此通路的抑制效應(yīng)。具體表現(xiàn)為S組和E組的MHC均顯著高于SL組（分別為17.6%和20%）。E組的mTOR（Ser2448）磷酸化顯著高于SL組和EL組（分別為32.9%和22.8%）。S組和E組的p70S6K（Thr389）磷酸化均顯著高于 SL組（分別為25%和 52.5%），EL組顯著高于 SL組（20%）。E組的4EBP1（Thr37／46）磷酸化顯著高于S組、SL組和EL組（分別為34%、36.7%和15.5%）（圖1）。

圖1 LY294002和運動干預(yù)下大鼠腓腸肌MHC和m TOR及其下游信號表達圖

3 討論

3.1 PI3K阻斷劑對運動骨骼肌蛋白合成的影響

PI3K為IGF-I發(fā)揮促合成效應(yīng)信號中非常重要的一個信號。PI3K在受其上游信號如生長因子、胰島素等激活后［6－7］，其在細胞膜上將二磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為三磷脂酰肌醇（PIP3），然后以 PIP3作為第二信使啟動下游的蛋白［8］。對PI3K信號的阻斷，能夠很大程度地影響位于其下游的 Akt和 mTOR信號［9］。因而形成 IGI-I／PI3K／Akt／mTOR通路，影響機體的蛋白質(zhì)代謝過程。在該通路中的mTOR信號分子及其下游信號是肌肉肥大過程中的關(guān)鍵因子。Bodine（2001）等［1］發(fā)現(xiàn)使用 mTOR信號分子的特異性阻斷劑——雷帕霉素，能阻斷95%的肌肉肥大效應(yīng)。

LY294002為PI3K的特異性抑制劑，它能抑制PI3K家族的活性，這種抑制效應(yīng)呈一定的劑量依賴［3］。研究實驗所取材組織為腓腸肌，為典型的以快肌纖維為主的肌肉，其MHCIIb型達到約90%，IId／x型約10%［10］。本研究測試的MHC為快肌型。研究結(jié)果顯示，一周跑臺運動具有促進腓腸肌MHC增加的趨勢（P＞0.05），LY294002明顯抑制MHC（P＜0.01），并明顯抑制運動對MHC的促進效應(yīng)。MHC的減少意味著肌肉收縮蛋白的丟失。PI3K阻斷劑能抑制肌肉收縮蛋白的合成，并能顯著抑制運動所引起的促合成效應(yīng)。

3.2 PI3K阻斷劑對運動骨骼肌mTOR及下游信號的影響

mTOR的促合成效應(yīng)主要是通過對p70S6K和4EBP1的磷酸化來實現(xiàn)的。mTOR的下游信號p70S6K磷酸化后，能促進5’TOPmRNA翻譯，提高 mRNA的翻譯能力［11，12］；另外一個下游信號4EBP1磷酸化后可調(diào)節(jié)eIF4E的活性，來提高翻譯的起始效率，從而促進翻譯的起始和延伸過程，增加蛋白合成［13］，最終導(dǎo)致骨骼肌肥大。mTOR的這兩種下游信號能被雷帕霉素所阻斷，并能在離體情況下被重組mTOR所激活［14，15］。Fujita等［16］發(fā)現(xiàn)促人體合成的營養(yǎng)素能敏感地被mTOR所感受到，引發(fā)一個迅速地和有效地通過加強翻譯的起始和延伸過程（mTOR、p70S6K、4EBP1磷酸化均顯著增加），來促進人骨骼肌蛋白的合成。在體情況下，由Akt／mTOR通路所激活的基因能充分地引起肌肉肥大，阻止肌肉萎縮；而它們的阻斷劑能阻斷在體情況下的肌肉肥大。本研究發(fā)現(xiàn)，一周注射LY294002能夠使mTOR（Ser2448）蛋白磷酸化水平顯著抑制約15%。

p70S6K參與mRNA轉(zhuǎn)錄的起始過程，它被認為是這一過程所必需的［12］。雖然這些轉(zhuǎn)錄僅為100到200個基因，但他們能編碼細胞mRNA的20%。這些編碼的產(chǎn)物有核糖體蛋白、延長因子等，這些都是蛋白質(zhì)生物合成的基因，p70S6K調(diào)控著翻譯組件的生物合成［17］。它可以磷酸化調(diào)節(jié)mRNA翻譯過程中的至少3種蛋白，包括elF4B、核糖體蛋白S6和真核翻譯延伸因子eEF2。其Thr389位點的磷酸化是p70S6K被激活的標志。本研究發(fā)現(xiàn)，一周注射LY294002能使p70S6K（Thr389）蛋白磷酸化水平顯著抑制約20%。

4EBP1即eIF4E結(jié)合蛋白，又稱PHAS1。真核細胞mRNA翻譯的有效起始依賴于eIF-4F復(fù)合體，后者由eIF-4E、eIF-4A、eIF-4G組成。eIF-4E和eIF-4G的活性被eIF-4E結(jié)合蛋白——4EBP所抑制。4EBP1能抑制翻譯起始所必需的帽子結(jié)構(gòu)，進而控制翻譯過程［18］。Gregory［14］HEK293細胞的鼠PHAS-1基因進行轉(zhuǎn)染，或者用野生型mTOR，或者用雷帕霉素抵抗型mTOR的基因突變，發(fā)現(xiàn)不管是在體還是離體，4EBP1激酶的活性受到mTOR功能的直接影響。本研究發(fā)現(xiàn)，一周注射 LY294002能使4EBP1（Thr37／46）蛋白磷酸化水平顯著抑制約2%。

本研究顯示，一周的實驗后，mTOR及其兩個重要下游信號p70S6K和4EBP1的活性均表現(xiàn)出明顯抑制，且變化趨勢相似。在mTOR活性表達有一定抑制后，位于其下游的p70S6K和4EBP1的活性均有更為顯著的變化。這些結(jié)果提示LY294002通過抑制PI3K后，通過mTOR作用于其下游信號p70S6K和4EBP1，從而對蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——翻譯過程產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

通過前期的研究，本研究所選用的模型為具有抗阻效應(yīng)的跑臺練習(xí)［19，20］。實驗結(jié)果顯示，LY294002顯著抑制mTOR（Ser2448）（P＜0.01）、p70S6K（Thr389）（P＜0.01）和4EBP1（Thr37／46）（P＜0.05）的磷酸化表達，而運動明顯增強其表達。外源性LY294002和運動因素間存在交互效應(yīng)，運動減弱LY294002對此通路的抑制效應(yīng)。

3.3 PI3K阻斷劑和運動對骨骼肌mTOR及下游信號影響

研究結(jié)果表明，PI3K阻斷劑抑制骨骼肌蛋白合成，運動促進其蛋白合成，且能減弱PI3K阻斷劑對MHC的抑制效應(yīng)。表現(xiàn)為一周的實驗后，LY294002明顯抑制MHC，運動有促進的趨勢，并減弱LY294002對MHC的抑制效應(yīng)。此外，運動和LY294002對運動骨骼肌mTOR及其下游信號影響的側(cè)重點有所不同。如實驗結(jié)果所顯示，LY294002對該通路的影響是整體性的，通過對PI3K的直接抑制，而使其下游信號受到相當(dāng)?shù)挠绊?。本研究結(jié)果顯示，在阻斷PI3K后，4EBP1活性的變化并不明顯，只有2%的降低；而對運動則更為敏感，有34%的升高。而p70S6K則表現(xiàn)出對二者均相當(dāng)敏感。對PI3K的阻斷，可使p70S6K有20%的降低；而相對于運動，則有22%的升高。而mTOR信號的變化幅度基本小于其下游信號的變化，對PI3K阻斷劑和運動分別有15%的降低和13%的升高。顯示出mTOR作為始動因素，其下游信號隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。mTOR的兩個下游信號對運動均較敏感，但4EBP1對PI3K阻斷劑的反應(yīng)似乎較為遲鈍。

4 結(jié)論

1）一周外源性PI3K阻斷劑注射明顯抑制mTOR及下游信號，并能顯著抑制運動所引起的蛋白促合成效應(yīng)。

2）mTOR的兩個下游信號對運動均較敏感，但4EBP1對PI3K阻斷劑的反應(yīng)較為遲鈍。

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責(zé)任編輯：喬艷春

Exercise and Blocking PI3K on m TOR and Downstream s ofm TOR of Skeletal M uscle in Rats

ZENG Fanxing1，ZHU Han1，ZHAO Hua2，OUYANG Qian1
（1.School of Human Sports Science，Beijing Sport University，Beijing 100084，China；2.Sports School，Tianshui Normal University，Tianshui741001，Gansu，China）

Aim：the purpose of this study was to exam ine the effect ofm TOR and downstream ofm TOR onmuscle protein synthesis in resistance treadm illexercisemodel through blocking PI3K in vivo.Methods：adultmale Sprague-Daw ley rats（8 weeks old）were random ly divided into 4 groups after adaptive training：sedentary（S），LY294002 group（SL），exercise group（E）and LY294002 plus exercise group（EL）.The follow ing treadm ill training was applied：20m／m in at10%slope，60 m in；once per day，7 days.Rats were treated daily w ith Either 8%ethanol or LY294002（5.5mg／kg，diluted w ith 8%ethanol）intraperitoneal injection for 7 days.The MHC and phosphorylation of mammalian target of rapamycin（m TOR）（Ser2448），70-kDa ribosomal protein S6 kinase（p70S6K）（Thr389），eIF4E binding protein 1（4EBP1）（Thr37／46）of gastrocnem iusmuscle were determ ined by Western blotting.Results：after 1 week，MHC was significantly inhibited by LY294002.Exercise had a tendency to increase MHC，and it attenuated the inhibitory effect of LY294002 on MHC.Phosphorylation ofm TOR（Ser2448）（P＜0.01），p70S6K（Thr389）and 4EBP1（Thr37／46）were significantly inhibited by LY294002，but they were elevated by exercise.Exercise had synergy effectw ith blocking PI3K in vivo.And exercise could attenuate the inhibitory effect of LY294002.Conclusions：these results suggest that：1）The phosphorylation ofm TOR and downstreams ofm TOR of skeletalmuscle was inhibited significantly by blocking on PI3K，and attenuated the effect of exercise in vivo.2）Downstreams of m TOR were all sensitive to exercise，but 4EBP1 was little sensitive to blocking on PI3K.

PI3K；LY294002；m TOR pathway；hypertrophy；exercise

G804.4

A

1004－0560（2010）06－0082－05

2010-11-10；

2010-12-03

國家自然科學(xué)基金項目（批準號30671013）。

曾凡星（1956－），男，教授，主要研究方向為體育運動中內(nèi)分泌變化及適應(yīng)機制研究。