發(fā)酵秸稈糖產(chǎn)丁二酸放線桿菌的CO2固定關(guān)鍵酶特性分析

薛培儉, 姜紹通, 李興江, 楊為華, 潘麗軍

(1.安徽豐原集團(tuán)控股有限公司,安徽 蚌埠 233010;2.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

丁二酸廣泛應(yīng)用于化工、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域,丁二酸可以合成百種以上的其它化學(xué)品,是最為重要的平臺(tái)化學(xué)品之一。目前丁二酸主要依賴(lài)石化原料制備,使其廣泛應(yīng)用受到限制[1]。

農(nóng)作物秸稈是最重要的生物質(zhì),以可再生的秸稈糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸日益受到人們的重視,尤其因?yàn)槠浒l(fā)酵菌種具有固定CO2的特征,不僅擺脫了對(duì)石化原料的依賴(lài),更開(kāi)辟了溫室氣體CO2利用的新途徑,使得丁二酸的微生物轉(zhuǎn)化成為一個(gè)最具發(fā)展?jié)摿Φ木G色模式[2]。

丁二酸作為三羧酸循環(huán)的中間體,在其發(fā)酵過(guò)程中,由其前體物質(zhì)草酰乙酸的兩步氫化反應(yīng)制備得到[3],而草酰乙酸最主要的生成途徑是來(lái)自于磷酸烯醇式丙酮酸與CO2的固定,這一途徑既是該類(lèi)菌吸收溫室氣體(CO2)的主要途徑,也是其代謝關(guān)鍵酶所在。

文獻(xiàn)[4-6]研究表明,作為兼性厭氧產(chǎn)丁二酸菌,丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succiniogenes)胞內(nèi)具有一大類(lèi)重要的酶,其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶充當(dāng)著最為重要的角色,在發(fā)酵過(guò)程中該酶保持著相當(dāng)高的酶活。因此,本文在對(duì)菌株該關(guān)鍵酶克隆測(cè)序基礎(chǔ)上,圍繞該關(guān)鍵酶的酶活測(cè)定以及各種因素對(duì)關(guān)鍵酶酶活力的影響進(jìn)行了重點(diǎn)分析,以期為發(fā)酵工藝的調(diào)控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株為產(chǎn)丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes S.JST),為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

發(fā)酵培養(yǎng)基為:酵母浸粉 10 g/L,玉米漿(CSL)15 g/L,Na2HPO4?12H2O 0.7 g/L,NaH2PO4?2H2O 1.16 g/L,NaCl 1.0 g/L,CaCl20.2 g/L,MnCl2?6H2O 0.2 g/L,MgCO340 g/L,秸稈糖80 g/L,胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)5 g/L。培養(yǎng)條件為在37℃搖瓶CO2厭氧發(fā)酵。

1.2 試劑和儀器

PCR反應(yīng)及DNA提取、回收試劑均購(gòu)自大連寶生物工程公司;細(xì)胞破碎儀為JY92-Ⅱ系統(tǒng);高效毛細(xì)管電泳色譜(HPCE)采用美國(guó)Beckman Coulter公司P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀;厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)為CBJS-5B/1。

1.3 Pepck關(guān)鍵酶基因克隆測(cè)序

克 隆 引 物 相 同,H1:5′-CCAACTAAT TTAGCCGCT TCC-3′,H2:5′-T TAGGGCT TACCGATGTTAAG-3′。

PCR反應(yīng):25 μ L PCR反應(yīng)體系中,dNTP(2.5 m)為 2 μ L,10 ×緩沖線為 2.5 μ L,H1(20 pmol)為1 μ L,H2(20 pmol)為 1 μ L,Taq 為0.2 μ L,模板DNA 為 1 μ L,用水補(bǔ)足到 25 μ L 。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃5 min;94℃40 s,

55℃40 s,72℃100 s,30個(gè)循環(huán);72℃10 min。

PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序:試劑盒純化 DNA;取 1 μ L回收的 PCR產(chǎn)物,按照pMD18T載體試劑盒操作,16℃連接1 h以上;取連接混合物3.5 μ L加到200 μ L感受態(tài)細(xì)胞液中,冰浴30 min后熱擊轉(zhuǎn)化;對(duì)陽(yáng)性克隆株進(jìn)行PCR鑒定;由大連寶生物工程公司完成序列測(cè)定。

1.4 酶活檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞酶液制備

取10 mL發(fā)酵培養(yǎng)菌懸液10 000 r/min離心獲得菌體,pH值為7.5,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL,冰浴超聲粉碎10 min(超聲2 s/間隔5 s),4℃下 10 000 r/min冷凍離心15 min,獲取上清液酶液。其中菌液為37℃條件下CO2厭氧氣室搖瓶培養(yǎng)24 h所得。之后取上清初酶液進(jìn)行硫酸銨沉淀純化,采用35%～55%飽和硫酸銨沉淀制備,即先用35%飽和硫酸銨沉淀,8 000 r/min冷凍離心15 min后,除去雜蛋白,取離心所得的上清液;而后飽和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至55%,10 000 r/min冷凍離心15 min后,獲取沉淀,將沉淀物用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)稀釋至10 mL,再用透析袋在4℃條件下3 h內(nèi)反復(fù)透析6次(透析液為pH=7.5的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖),透析結(jié)束后定容至10 mL,此時(shí)得到初步純化酶液。

1.4.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶測(cè)定

加入3 mL pH值為7.5,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)對(duì)照比色皿中,測(cè)定比色皿中加2.3 mL緩沖液,依次加入5 mmol/L MnCl2、0.5 mmol/L碳酸氫鈉、0.5 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸鈉、50 mmol/L的GDP(鳥(niǎo)嘌呤核苷二磷酸)、5 mmol/L NADH(還原輔酶Ⅰ)溶液各0.1 mL,置于25℃水浴中保溫,分別快速加入0.1 mL的500 U/mL蘋(píng)果酸脫氫酶純酶液與適量待測(cè)酶液,啟動(dòng)反應(yīng);在340 nm處,3 min內(nèi)每30 s以對(duì)照比色皿調(diào)零,記錄吸光度值,計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)吸光度的降低值ΔA。

1.4.3酶活的計(jì)算

酶活單位計(jì)算在本方法相當(dāng)于每分鐘直接或間接消耗1 μ mol NADH量,計(jì)算式如下:

酶活為每毫克酶蛋白所具有的酶活力,單位為U/mg,計(jì)算式如下:

其中,V為酶促反應(yīng)體積,指比色皿中酶液體積,為3 mL;ΔA為340 nm處吸光度的變化值,無(wú)量綱;b為比色皿的光程,取1 cm;ε為NADH的表觀摩爾消光系數(shù),取6.22×103 L/(mol?cm);Δ t為時(shí)間間隔,取3 min;x為向反應(yīng)比色皿內(nèi)加入的待測(cè)酶液體積;n為稀釋倍數(shù),n=3 000/x;ρ為比色皿中酶蛋白的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的Pepck關(guān)鍵酶基因克隆分析

對(duì)菌株P(guān)epck基因分析表明(Accession No.EU253567),該基因有1 617個(gè)堿基序列,編碼的蛋白酶為裂解酶類(lèi)中的羧激酶,國(guó)際酶學(xué)編號(hào)為EC4.1.1.32。

基于所獲序列及酶催化方式初步構(gòu)建其蛋白結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

通過(guò)生物信息學(xué)比較,發(fā)現(xiàn)該酶的結(jié)構(gòu)蛋白中除了具有經(jīng)典的底物結(jié)合位點(diǎn)及輔酶結(jié)合位點(diǎn)外,分別發(fā)現(xiàn)激酶常見(jiàn)的 Mn2+與Mg2+結(jié)合位點(diǎn),在264的異亮氨酸與272位的天冬氨酸分別為Mn2+結(jié)合位點(diǎn),在211位的賴(lài)氨酸與235位的纈氨酸分別為Mg2+結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 酶活分析

在整個(gè)發(fā)酵36 h期間,每6 h取一次樣,對(duì)樣品進(jìn)行酶活檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同發(fā)酵階段磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的酶活

通過(guò)酶活檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中該酶均維持較高酶活,尤其發(fā)酵中期24 h左右,酶活最高,因此后續(xù)條件試驗(yàn)均選取此時(shí)的酶進(jìn)行分析。

2.3 pH值對(duì)酶活影響

發(fā)酵體系中的pH值過(guò)低或過(guò)高對(duì)酶的催化都有不利影響,甚至使酶失活。本文測(cè)定了酶液在不同pH值緩沖液中的酶活,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的影響

從圖3可以看出,菌株的Pepck活性對(duì)環(huán)境的pH值變化較敏感,pH值為6.5～7.0時(shí)酶活較高,因此在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)及時(shí)添加中和劑,否則生成丁二酸過(guò)量則會(huì)造成發(fā)酵液的pH值過(guò)低,會(huì)進(jìn)一步抑制Pepck活性,而關(guān)鍵酶的被抑制對(duì)總體發(fā)酵是不利的。

2.4 不同離子對(duì)酶活的影響

在反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的MgSO4、ZnSO4、MnSO4及 CuSO4,考察離子對(duì) Pepck酶活的影響,其結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同離子對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的影響

由圖4可以看出,Mn2+與Mg2+對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶具有明顯的激活作用,Mn2+的濃度為0.1～0.2 mmol/L時(shí)就幾乎將酶活潛力完全激發(fā)了,而Mg2+的濃度要達(dá)到0.5 mmol/L以后方可檢測(cè)到酶的高活力。Zn2+對(duì)該酶沒(méi)有明顯影響,而Cu2+則對(duì)酶活具有明顯的抑制作用。因此在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)盡量減少Cu2+的存在,并提供一定的Mg2+濃度。同時(shí)在對(duì)2.1節(jié)中獲得的酶基因進(jìn)行保守序列分析時(shí)也發(fā)現(xiàn),該類(lèi)酶具有不止一處的Mg2+與Mn2+激活位點(diǎn)。

2.5 底物的影響

該酶在體系中催化的反應(yīng)為:

磷酸烯醇式丙酮酸+GDP+CO2(溶液體系中以HCO3-)=草酰乙酸+GT P。

分別以不同濃度的底物磷酸烯醇式丙酮酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷二磷酸(GDP)及HCO3-進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定相應(yīng)酶活,根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的 Hanes-Woolf法,求得該酶對(duì)以上底物的 Km依次為3.0×10-4mol/L、8.0×10-5mol/L及 7.0×10-2mol/L,由此可見(jiàn),該磷酸烯醇式丙酮羧化激酶對(duì)HCO3-的親和力最弱(H2CO3/HCO3-的電離常數(shù)為4.3×10-7,在緩沖體系中性的情況下,HCO3-轉(zhuǎn)化為CO2不是限制因素,所以該酶對(duì)HCO3-的親和力可以近似等效于對(duì)CO2的親和力),因此若要保證發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物的高效生成必須持續(xù)提供高濃度的HCO3-。

3 結(jié)束語(yǔ)

Actinobacillussuccinogenes是一種從牛瘤胃中分離產(chǎn)丁二酸菌[7],由于牛瘤胃具有高CO2含量的厭氧特性,使得所篩菌株具有固定CO2的能力,同時(shí)這也是該類(lèi)菌株最顯著的特征,因此圍繞其關(guān)鍵酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶)開(kāi)展研究具有重要意義。

本文在對(duì)關(guān)鍵酶克隆及酶活測(cè)定的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)分析了pH值、離子及底物對(duì)酶特性影響。其中pH值影響分析表明,必須持續(xù)添加中和劑,保證發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物丁二酸持續(xù)地累積,否則過(guò)酸的環(huán)境將對(duì)關(guān)鍵酶產(chǎn)生明顯的酶活抑制。不同離子的影響表明,有的離子具有明顯的抑制作用,如Cu2+,有的離子具有明顯的激活作用,如Mn2+與Mg2+,這就要求發(fā)酵過(guò)程中控制恰當(dāng)?shù)碾x子濃度,否則關(guān)鍵酶的抑制可能影響總體發(fā)酵。

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析表明,該酶對(duì)HCO3-親和力較弱,該酶的這種特性要求發(fā)酵過(guò)程中必須有足夠的HCO3-。因此在發(fā)酵過(guò)程中,維持發(fā)酵體系中添加過(guò)量的MgCO3作為中和劑,既可以維持發(fā)酵體系的 pH值中性,又可以提供Mg2+,同時(shí)又能保證溶液中一定量的HCO3-,這只是針對(duì)磷酸烯醇式羧化激酶獨(dú)立而言,就整個(gè)發(fā)酵體系而言,菌株可能還有其它更嚴(yán)格的要求,如極端的CO2厭氧條件等[8]。

[1] Chotani G,Dodge T,Hsu A,et al.The commercial production of chemicals using pathway engineering[J].Biochimica et Biophy sica Acta,2000,1543(2):434-455.

[2] Lee S Y,Hong S H,Lee S H,et al.Fermentative production of chemicals that can be used for polymer synthesis[J].M acromol Biosci,2004,4(3):157-164.

[3] 王慶昭,趙學(xué)明.產(chǎn)丁二酸菌種研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2007,23(4):570-576.

[4] M cKinlay J B,Shachar H Y,Zeikus J G,et al.Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NM R and GC-MS analyses of C-13-labeled metabolic product isotopomers [J].M etabolic Engineering,2007,9(2):177-192.

[5] McKinlay J B,Vieille C.13C-metabolic flux analysis of Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism at different NaHCO3and H2concentrations[J].M etabolic Engineering,2008,10(1):55-68.

[6] Cotelesage J J H,Prasad L,Zeikus J G,et al.Crystal structure of Anaerobiospirillum succiniciproducens PEP carboxy kinase reveals an impo rtant active site loop[J].InternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology,2005,37(9):1829-1837.

[7] 劉宇鵬,鄭 璞,倪 曄,等.抗氟乙酸突變株的選育及其代謝流量分析[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(3):460-467.

[8] 謝 鑫,陳可泉,劉忠敏,等.產(chǎn)丁二酸工程菌的構(gòu)建及其厭氧發(fā)酵[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(1):101-105.