三苯基錫對青萍生長及酶活性的影響

宋志慧，劉歌

青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，青島266042

三苯基錫對青萍生長及酶活性的影響

宋志慧*，劉歌

青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，青島266042

以青萍（Lemna mino）為實(shí)驗(yàn)生物，通過研究不同濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L-1）的三苯基錫（TPT）對青萍生長發(fā)育及過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性的影響，初步探討了TPT對水生浮萍植物的毒性作用，以期為及時(shí)發(fā)現(xiàn)并排除TPT污染提供理論和直觀依據(jù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：培養(yǎng)4d后，TPT對青萍葉片生長量的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.10mg·L-1；CAT、POD活性隨TPT處理濃度的升高顯著升高（各暴露組與對照組均差異顯著，p＜0.05）.結(jié)果顯示，TPT對青萍具有明顯的毒性作用，CAT和POD活性的變化可作為反映TPT污染脅迫的敏感指標(biāo).

三苯基錫；青萍；過氧化氫酶；過氧化物酶；IC50

1 引言（Introduction）

有機(jī)錫化合物作為人為引入環(huán)境的毒性最大的化合物之一（Lu et al.,2004），已經(jīng)引起了人們的普遍重視.目前有機(jī)錫化合物已廣泛存在于環(huán)境各介質(zhì)中，許多國家均將其列為優(yōu)先控制的有毒污染物（李紅莉等，2003）.有機(jī)錫化合物不僅對水生生物具有嚴(yán)重影響，而且對陸生生物甚至人類都會(huì)產(chǎn)生危害.對水生生物影響最大的有機(jī)錫化合物主要是毒性較大的三丁基錫（TBT）和三苯基錫（TPT），它們會(huì)從船體防污油漆中直接釋放到水中，使碼頭、湖泊、沿岸海域的水、沉積物和生物受到污染，同時(shí)研究表明，離岸較遠(yuǎn)的水域也會(huì)受到有機(jī)錫的污染（高峻敏和鄭澤根，2003）.調(diào)查表明，一些地區(qū)對TPT殺菌劑的使用量越來越大，噴灑的TPT農(nóng)藥會(huì)隨著雨水、徑流等直接進(jìn)入江河湖泊中，使地表水受到污染（Kannan and Lee,1996）.

浮萍科植物廣泛存在于各種水體中，通常能夠靈敏地反映水體污染狀況，研究TPT對水生浮萍科植物生理指標(biāo)的影響具有重要意義.青萍（Lemna minor）屬浮萍科，具有分布廣、繁殖快、易于打撈等優(yōu)點(diǎn)，是水生毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)材料，目前已被廣泛應(yīng)用于廢水處理和水生植物污染生態(tài)學(xué)等研究中（K?rner et al.,2003;Cheng et al.,1998;宋志慧和黃國蘭，2005）.然而有關(guān)TPT對青萍的影響尚未見報(bào)道.

國內(nèi)外許多學(xué)者已對TPT對海洋生物的毒性效應(yīng)進(jìn)行了很多研究（徐明德和杜春梅，2001;王永芳，2003;Botton et al.,1998），但對淡水生物的研究相對較少.本實(shí)驗(yàn)以青萍作為實(shí)驗(yàn)生物，通過不同濃度的TPT對青萍生長發(fā)育及抗氧化酶活性的影響，初步探討了TPT對水生植物的毒性作用，以期為及時(shí)發(fā)現(xiàn)并排除TPT的污染提供理論和直觀依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

青萍（Lemna minor），采自福州某無污染荷花池，在此荷花池中檢測未發(fā)現(xiàn)TPT的存在.挑選個(gè)體健壯、葉片完好的植株在光照培養(yǎng)箱中，（26±2）℃、14/10光暗比，（4000±100）Lux條件下用1/2 Hoagland培養(yǎng)液（Song and Huang,2005）培養(yǎng).當(dāng)青萍數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需時(shí)，篩選出健康的植株，選擇葉片數(shù)相同、生長狀態(tài)一致的青萍進(jìn)行毒性作用實(shí)驗(yàn).

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)以1/2 Hoagland培養(yǎng)液為稀釋液，分別加入一定量的TPT，使TPT的濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L－1（以Sn計(jì)），以培養(yǎng)液為對照，在250mL燒杯中分別加入上述實(shí)驗(yàn)液100mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)燒杯放40個(gè)葉片，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4d，每2天換1次處理液,同時(shí)記錄燒杯中的青萍葉片數(shù).

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 TPT對青萍的4d-IC50實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)濃度每2d紀(jì)錄青萍葉片數(shù).其4d的IC50的計(jì)算公式如下（Song and Chen,1998）：

速率Vt：

式中：t為時(shí)間（d）；Nt為時(shí)間t時(shí)青萍葉片數(shù)；N0為初始時(shí)青萍葉片數(shù)；Vt為時(shí)間t時(shí)的生長速率；In為染毒組的抑制百分率；Vn為染毒組處理n的生長速率；V0為對照組的生長速率.將In與實(shí)驗(yàn)液化合物濃度的對數(shù)進(jìn)行線性回歸，求出半數(shù)抑制濃度（IC50）.進(jìn)行回歸分析，其中，相關(guān)系數(shù)r為正值，為正相關(guān)；r為負(fù)值，為負(fù)相關(guān)；顯著性水平p＜0.05為顯著相關(guān)，p＜0.01為極顯著相關(guān).

記錄青萍的植物體數(shù)時(shí)，為避免主觀判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)為在10位放大鏡下觀察青萍，只要新的植物體伸出母體的邊緣，就將其計(jì)算在內(nèi).對于老化而死亡、失去色素變白變黃的個(gè)體不記錄.青萍植物體數(shù)的增加表示青萍的生長，各處理組與對照組的差異表示TPT對青萍的毒性效應(yīng)（徐楠等，2002）.

2.3.2 TPT對青萍酶活性的影響

酶是活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的具有高度專一性和催化效率的蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種細(xì)胞中，催化細(xì)胞生長、代謝等生命過程中幾乎所有的化學(xué)反應(yīng).過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）是生物體中廣泛存在的酶，國內(nèi)外大量研究表明，當(dāng)植物處于逆境條件下，體內(nèi)大量積累的活性氧可誘導(dǎo)膜脂過氧化，使細(xì)胞膜最先受到傷害.而POD和CAT是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶系統(tǒng)，二者相互協(xié)調(diào)，可有效地清除代謝過程中產(chǎn)生的活性氧對脂膜的過氧化及其他傷害過程（宋美芳和李杰，2005）.本研究選擇這兩種酶作為指示TPT對青萍生理生化指標(biāo)的影響.

實(shí)驗(yàn)懸浮液的制備（荊家海和丁鐘榮，1981）：用電子分析天平稱量青萍，加入2mL pH 6.4的0.2mol·L－1磷酸緩沖液，研磨后將研缽中的內(nèi)含物用蒸餾水定容至50mL，保存在4℃下備用.為測定POD的活性，取25mL懸浮液用10%硝酸鈣溶液定容至50mL，在定期搖動(dòng)下停放30～40min后使用.

CAT的測定：取10mL青萍的酶懸浮液，加溫到20℃后，加入5mL 0.1mol·L－1過氧化氫，經(jīng)過5min后，加入5mL硫酸（1:9）終止反應(yīng)后加入1mL 20%的碘酸鉀，滴入3滴10%鉬酸銨作為催化劑，在1mL 0.5%淀粉存在下，用0.02mol·L－1的硫代硫酸鈉滴定，從而計(jì)算出酶的活性.過氧化氫酶的活性按參考文獻(xiàn)（荊家海和丁鐘榮，1981）進(jìn)行計(jì)算.

POD的測定：取1mL左右的青萍的酶懸浮液置入干燥比色管中，加入7mL蒸餾水，1mL 0.3%愈創(chuàng)木酚，搖勻，浸入20℃水中，當(dāng)對照試管的溫度達(dá)到水浴溫度時(shí)，加入0.5mol·L－1的過氧化氫溶液1mL.此后將溶液立即搖勻，并仍放入水浴中.加入過氧化氫后15min，用波長440nm比色皿厚度10mm的分光光度計(jì)，準(zhǔn)確測定光密度.過氧化物酶的活性按參考文獻(xiàn)（荊家海和丁鐘榮，1981）進(jìn)行計(jì)算.

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.采用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析.

3 結(jié)果（Results）

3.1 TPT對青萍植株體生長的影響

TPT對青萍株體的毒性作用如表1所示.同一時(shí)間下，隨TPT濃度的升高，青萍葉片數(shù)呈逐漸降低趨勢，抑制百分率呈逐漸升高趨勢，表明TPT對青萍生長具有明顯毒性作用.

表1 TPT對青萍的毒性作用（葉片數(shù)）Table 1Toxic effects of TPT on Lemna minor（the number of leaf）

通過將TPT濃度的對數(shù)（lnC）為橫坐標(biāo)，抑制百分率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用圖解法得到TPT對青萍4d的IC50值為0.10mg·L－1.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，在4d的處理時(shí)間內(nèi)，隨著處理濃度的增加，TPT對青萍生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)，相比于對照組，各暴露組中青萍的生長速率明顯下降.在實(shí)驗(yàn)過程中觀察到，當(dāng)TPT濃度高于0.12mg·L－1時(shí)，青萍周圍出現(xiàn)白色沉積物，培養(yǎng)液變?yōu)榘咨珳啙嵛?，青萍出現(xiàn)葉片輕微變黃，脫根和植株分離現(xiàn)象，濃度增大時(shí)，開始出現(xiàn)枯死葉片，到0.20mg·L－1時(shí)，葉片數(shù)開始停滯，新生葉片長不大.這主要是因?yàn)門PT主要通過根和葉吸收，并傳導(dǎo)進(jìn)入青萍體內(nèi)，影響細(xì)胞分裂，從而造成青萍的生長停止.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，TPT對青萍生長具有明顯的毒性作用，由于青萍等浮萍植物處于水生食物鏈的低端，因此TPT可能會(huì)通過生物濃縮現(xiàn)象經(jīng)食物鏈的逐級放大傳遞給更高營養(yǎng)級的生物，甚至可能影響到人類的健康.

3.2 TPT對青萍抗氧化酶活性的影響

TPT對青萍CAT活性的影響如圖1所示.從圖1可以看出，相同培養(yǎng)液條件下，隨著TPT處理濃度的增加，CAT活性顯著升高，各暴露組與對照組均差異顯著（p＜0.05）.

TPT對青萍POD活性的影響如圖2所示.與CAT類似，相同培養(yǎng)液條件下，隨著TPT處理濃度的增加，POD活性顯著升高，各暴露組與對照組均差異顯著（p＜0.05）.

CAT和POD作為生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)酶，具有非常重要的生理功能，其中最為主要的就是參與活性氧代謝過程.在活性氧代謝過程中，CAT和POD可以使H2O2等過氧化物發(fā)生歧化生成水和氧分子（Van Breusegem et al.,2001），使其維持在低水平上，保護(hù)膜透性，減少植物受到的損傷（Gelain et al.,2008）.在環(huán)境脅迫等逆境情況下，生物體內(nèi)廣泛存在活性氧爆發(fā)現(xiàn)象，導(dǎo)致自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞和損傷，而CAT和POD是體內(nèi)清除自由基的酶促防御系統(tǒng)之一（Jin et al.,2008）.CAT和POD活性隨TPT處理濃度顯著增加是因?yàn)镃AT和POD在TPT脅迫的逆境情況下機(jī)體為避免過氧化產(chǎn)生了大量CAT和POD，組成了酶促防御系統(tǒng)，保護(hù)了膜透性，從而減少了植物受到的損傷（馬文麗等，2004）.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，0.04mg·L-1TPT污染即可導(dǎo)致青萍CAT和POD發(fā)生顯著變化，因此青萍CAT和POD活性可作為反映水體TPT污染的敏感脅迫指標(biāo).

致謝：本論文得益于社會(huì)科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目（03CJZ03）、山東省博士基金項(xiàng)目（03DS125）、山東省高等學(xué)校實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目（2005-188），特此表示感謝.

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ToxicEffectsofTriphenyltinontheGrowthandtheRelated Enzymic Activities of Lemna minor

SONG Zhi-hui*，LIU Ge

College of Environment and Safety Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042

Toxic effects of triphenyltin（TPT）（0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20mg·L-1）on the growth and the related enzymic（catalase（CAT）,peroxide（POD））activities of Lemna minor was researched in this study.Results showed that the 96h IC50of TPT for the number of Lemna minor’s leaf was 0.10mg·L-1.The CAT and POD activities increased significantly with the increasing of TPT concentrations（compared with the control,p＜0.05）.The results indicated that TPT has toxic effect on Lemna minor and the activity of CAT and POD can be used as the sensitive indicator of TPT in aquatic environment.

triphenyltin（TPT）；Lemna minor；catalase（CAT）；peroxide（POD）；IC50

25 February 2009accepted5 April 2009

1673-5897（2010）1-118-05

X171.5

A

2009-02-25錄用日期：2009-04-05

山東省社會(huì)科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目（No.03CJZ03）；山東省博士基金項(xiàng)目（No.03DS125）；山東省高等學(xué)校實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.2005-188）

宋志慧（1972—），副教授；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:songhuey@sina.com

宋志慧（1972—），男，博士，副教授.