PCR方法快速檢測(cè)食品中幽門螺桿菌

史艷宇，劉金華，安 偉，李媛媛，王 瑩，朱 穎，王 偉，劉俊會(huì)

(1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062)

PCR方法快速檢測(cè)食品中幽門螺桿菌

史艷宇1，劉金華2，安 偉1，李媛媛1，王 瑩1，朱 穎1，王 偉1，劉俊會(huì)1

(1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062)

目的：建立一種快速、特異、靈敏的幽門螺桿菌檢測(cè)方法。方法：以尿素酶基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法。以食品中常見致病菌作參考菌株作特異性檢測(cè)，分別對(duì)幽門螺桿菌菌懸液及鮮牛奶中幽門螺桿菌菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，提取DNA后做靈敏度檢測(cè)。結(jié)果：PCR方法能夠有效對(duì)幽門螺桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)，具有較強(qiáng)的特異性，靈敏度較高(8CFU/mL)。結(jié)論：該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中污染的幽門螺桿菌。

幽門螺桿菌；尿素酶基因；P CR；檢測(cè)

Abstract：The contamination ofHelicobacter pyloriis considered as a serious problem to impair public health in both developed and developing countries. In order to establish a fast, specific and sensitive method to detect the contamination ofHelicobacter pyloriin food, PCR method was used to detect the DNA ofHelicobacter pyloribased on urease gene. Results indicated that this method was highly specific toHelicobacter pyloriand sensitive and presented a limit detection of 8 CFU/mL forHelicobacter pylori. Therefore, this method is applicable to clinical practice, environment control and inspection of exported food.

Key words：Helicobacter pylori；urease gene；PCR；detection

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種彎曲、螺旋狀革蘭氏陰性桿菌。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，罹患胃病的人群中，有超過50%的人感染幽門螺桿菌，幽門螺桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤和胃腺癌的發(fā)生有關(guān)[1-2]，WHO已經(jīng)將幽門螺桿菌列為第一類致癌因子[3]。由于幽門螺桿菌與人類常見病密切相關(guān)且在人群中感染率高，因而受到重視。

幽門螺桿菌對(duì)體外生長(zhǎng)條件要求苛刻，培養(yǎng)困難，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式對(duì)于快速準(zhǔn)確進(jìn)行檢測(cè)與鑒定有一定難度[4]。因此如何快速檢驗(yàn)這些食品中的幽門螺桿菌，保證人民食品安全，是一個(gè)重要課題。除了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外幽門螺桿菌其他檢測(cè)方法主要有：直接鏡檢法、染色法、尿素酶法、免疫學(xué)法、核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基因蕊片、毛細(xì)管電泳技術(shù)等[5]。這些方法在臨床樣品檢測(cè)方面應(yīng)用較多，但在食品中幽門螺桿菌檢測(cè)方面應(yīng)用較少，目前國(guó)內(nèi)尚無食品中幽門螺桿菌快速有效檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

近年來大量研究證明，食品在人類感染幽門螺桿菌中起到重要作用，是幽門螺桿菌傳播的途徑之一[6-7]。因此研究食品中幽門螺桿菌的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定方法尤其必要。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

鮮牛奶和雞肉 市售。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，ATCC 43504)；大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 13565)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC 15313)；沙門氏菌(Salmonella typhimurium，AS1.1194)；空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，ATCC 33291)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組小量提取試劑盒(AxyPrepTMMultisource Genomic DNA Miniprep Kit) 美國(guó)Axygen公司；TaqHS DNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10×buffer緩沖液、6 ×Loading buffer、100bp DNA Ladder Marker等寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHIB，根據(jù)產(chǎn)品說明書配制)青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；胰蛋白大豆瓊脂 美國(guó)Becton Dickinson公司；ICPBIO無菌小牛血清 新西蘭ICPBIO生物技術(shù)(集團(tuán))有限公司；無菌脫纖維馬血煙臺(tái)開發(fā)區(qū)品格林實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)備有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Microfuge 22R Centrifuge高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；M20食物研磨器 德國(guó)IKA公司；Tgradient-96 PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；Bio Specmini DNA/RNA/蛋白分析儀 日本島津公司；SAVANT PS500A電泳儀 美國(guó)Savant公司；EDAS290凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Kodak公司；生化恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)賓得公司；微量移液器(0.1～1000μL) 法國(guó)Gilson公司；M308277恒溫水浴鍋 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；厭氧罐 日本三洋公司。

1.4 方法

1.4.1 幽門螺桿菌的稀釋與計(jì)數(shù)

取幽門螺桿菌凍干粉接種于BHIB增菌肉湯培養(yǎng)基，按照5%培養(yǎng)基體積量加入無菌小牛血清，于微需氧條件下37℃振蕩培養(yǎng)3d，在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定培養(yǎng)液吸光度。在吸光度達(dá)到1.0時(shí)，取1mL菌液涂胰蛋白大豆瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(單位CFU/mL)，另取1mL菌液用作模板DNA的提取。

1.4.2 DNA的提取

取幽門螺桿菌培養(yǎng)物，按細(xì)菌基因組小量提取試劑盒說明書的方法進(jìn)行DNA提取，但相關(guān)步驟要略作修改：延長(zhǎng)裂解酶作用時(shí)間至20min。用DNA分析儀檢測(cè)其純度及濃度。

1.4.3 幽門螺桿菌引物設(shè)計(jì)

根據(jù)幽門螺桿菌尿素酶基因，在Genebank中檢索到1個(gè)基因序列(Accession M60398)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物。在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中，經(jīng)Blast軟件對(duì)相似序列搜索后，篩選出一套最優(yōu)與常見致病菌無交叉反應(yīng)的引物。

Forword primer：5＇-AAGCTTTTAGGGGTG TTAGGGGTTT-3＇；

Reverse primer：5＇-CAAGCCATCGCCGG TTTTAGC-3＇，擴(kuò)增片段249bp。

1.4.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系(共20μL)：10×Ex TaqBuffer(Mg2+plus)2μL，dNTPs Mixture (各2.5mmol/L) 2μL，上下游引物(20μmol/L)各1μL，Ex Taq(5U/μL) 1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 11μL。

反應(yīng)條件：階段1：95℃預(yù)變性2min；階段2：94℃變性1min，61℃退火20s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；階段3：72℃延伸5min。

1.4.5 特異性實(shí)驗(yàn)

分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌等食品中常見致病菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.4.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

取1mL在1.4.1節(jié)計(jì)數(shù)過的幽門螺桿菌菌懸液，梯度稀釋后，分別提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的靈敏度。

1.4.7 PCR方法用于實(shí)際食品樣品檢測(cè)

取鮮牛奶、雞肉(制成勻漿)樣品9mL與3mL幽門螺桿菌菌懸液充分混勻、離心，取沉淀提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4.8 PCR方法測(cè)定牛奶中幽門螺桿菌的靈敏度

取1mL計(jì)數(shù)過的幽門螺桿菌菌懸液與9mL牛奶樣品混合均勻，用牛奶分別進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別提取DNA，按上述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)食品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)方法靈敏度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素酶基因特異性驗(yàn)證

在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌的DNA為特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，僅有幽門螺桿菌被擴(kuò)增出條帶，而其他對(duì)照以及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶，具體結(jié)果見圖1。

圖1 幽門螺桿菌PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Specificity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別取各濃度幽門螺桿菌菌懸液，提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示利用尿素基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)幽門螺桿菌的檢測(cè)敏感性可達(dá)到8CFU/mL，具體結(jié)果見圖2。

圖2 PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Sensitivity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.3 應(yīng)用尿素酶基因檢測(cè)人工污染樣品中的幽門螺桿菌

應(yīng)用尿素酶基因的特異引物對(duì)人工污染的鮮牛奶及雞肉進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能有效檢測(cè)出試樣中的幽門螺桿菌，具體結(jié)果見圖3。

圖3 檢測(cè)人工污染樣品中的幽門螺桿菌Fig.3 PCR detection ofHelicobacter pyloriin artificially contaminated samples

2.4 PCR方法測(cè)定鮮牛奶中幽門螺桿菌的靈敏度

取1mL計(jì)數(shù)過的幽門螺桿菌菌懸液與牛奶混合，梯度稀釋后分別提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示牛奶中幽門螺桿菌的檢測(cè)敏感度達(dá)到8CFU/mL，具體結(jié)果見圖4。

圖4 牛奶基質(zhì)對(duì)PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.4 Sensitivity of PCR detection forHelicobacter pylori-contained milk

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)尿素酶基因設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立食品中幽門螺桿菌的PCR檢測(cè)方法，填補(bǔ)了食品中幽門螺桿菌檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)的空白。與以往相關(guān)研究方法比較，本研究方法具有快速、靈敏(靈敏度為8CFU/mL)、特異的特點(diǎn)。

[2] GUILLERMO I P, ROTHENBACHER D, BRENNER H. Epidemiology ofHelicobacter pyloriinfection[J]. Helicobacter, 2004, 9(2):1-6.

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Rapid PCR Detection ofHelicobacter pyloriin Food

SHI Yan-yu1，LIU Jin-hua2，AN Wei1，LI Yuan-yuan1，WANG Ying1，ZHU Ying1，WANG Wei1，LIU Jun-hui1
(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China；2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

Q939.1

A

1002-6630(2010)18-0255-03

2009-12-15

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局項(xiàng)目(2008QK059)

史艷宇(1977—)，女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：shiyanyu219@163.com