苦瓜傷流液對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降糖功能研究

董 英，朱晶英，陳 鈞

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

苦瓜傷流液對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降糖功能研究

董 英1，朱晶英1，陳 鈞2

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

研究苦瓜傷流液(Momordica charantiaL. Bleeding Sap，MBS)對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降血糖功能并探索其作用機(jī)理。選用ICR小鼠60只，隨機(jī)抽取10只作空白對(duì)照，余下50只禁食17～18h后腹腔注射STZ 170mg/(kg bw·d)。取血糖值在11.1mmol/L以上者隨機(jī)分組，共3組：模型組、二甲雙胍組(200mg/(kg bw·d))和 MBS組(200mg/(kg bw·d))。連續(xù)灌胃30d后，測定小鼠空腹血糖、血清胰島素、血脂水平及肝糖原含量。解剖取胰腺，采用石蠟包埋、HE染色，做組織切片觀察。結(jié)果顯示：苦瓜傷流液能顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖值及血脂水平，增加血清胰島素和肝糖原含量；胰腺切片提示，苦瓜傷流液能夠改善胰島組織功能，促進(jìn)胰島β細(xì)胞修復(fù)。結(jié)果表明苦瓜傷流液能促進(jìn)糖尿病小鼠受損胰島β細(xì)胞修復(fù)、刺激胰島素分泌、增加肝糖原合成、調(diào)節(jié)血脂代謝，從而起到降低血糖的作用。

苦瓜；傷流液；降血糖功能；機(jī)理

Abstract：The present study was aimed at studying the antihyperglycemic effect and its mechanism ofMomordica charantiaL.bleeding sap (MBS) on streptozotocin-induced diabetic mice. Ten mice were selected randomly as control, while another 50 mice were injected with STZ 170 mgkg bw after fasting for 17–18 h to induce diabetes. The diabetic mice were divided into 3 groups:model group, metformin group (200 mg/(kg bw·d)) and MBS group (200 mg/(kg bw·d)). After 30 days of gavage administration, the levels of fasting blood glucose and blood-fat, serum insulin and hepatic glycogen content were examined. The paraffin sections of pancreas, stained with HE, were made into pathological sections for observation. The results showed that MBS could significantly reduce the levels of fasting blood glucose and blood-fat in diabetic mice, with an increase in hepatic glycogen and insulin content. The pathological sections showed that MBS improved the function of pancreas islet tissues,accelerate the renovation of pancreaticβcells in diabetic mice. The above results indicate that MBS can accelerate the repair of pancreatic inletβcells injured by streptozotocin, stimulate the secretion of insulin, increase the synthesis of hepatic glycogen and regulate blood lipid metabolism so as to reduce blood glucose level of diabetic mice.

Key words：Momordica charantiaL；bleeding sap；antihyperglycemia effect；mechanisms

苦瓜降糖活性成分的研究已經(jīng)開展了近半個(gè)世紀(jì)。早在1960年，即有研究表明正常的家兔和四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病家兔灌服苦瓜漿汁后，其血糖水平明顯降低。其后許多文獻(xiàn)報(bào)道，苦瓜的果肉、種籽、葉子和整個(gè)植株對(duì)正常小鼠、四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠、鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病小鼠及基因誘變糖尿病小鼠都具有顯著降血糖作用[1-7]。既往的研究工作主要圍繞著苦瓜肉、苦瓜籽提取物的降糖活性成分與應(yīng)用開發(fā)，到目前為止，苦瓜中仍有尚未探明的降血糖活性成分，對(duì)苦瓜傷流液(Momordica charantia L. Bleeding Sap，MBS)的降血糖活性研究未見報(bào)道。

關(guān)于瓜果類植物傷流液的功能和化學(xué)組成的研究鮮見報(bào)道。美國學(xué)者從黃瓜的傷流液中分離到28kD的幾丁質(zhì)酶片段，并且還從黃瓜和南瓜的傷流液中分離到了類凝集素的蛋白質(zhì)片段XSP(xylem sap protein)30[8]；絲瓜傷流液是我國傳統(tǒng)中藥，又名為“天羅水”，加白糖煮沸內(nèi)服，可“鎮(zhèn)咳、治頭痛、腹痛、感冒、腳氣水腫和酒精中毒等”，近代醫(yī)學(xué)用來治療神經(jīng)性皮炎有一定的效果[9]；葡萄樹傷流液中含有多種營養(yǎng)成分，具有很強(qiáng)的抗氧化活性及熱穩(wěn)定性[10]，是一種潛在的天然抗氧化劑。

MBS是在苦瓜收獲即將結(jié)束時(shí)，將其主莖在一定高度切斷后，在其切口處收集的流出液。因其不影響苦瓜收成，是對(duì)苦瓜資源充分利用的極好途徑。本研究對(duì)MBS的降血糖功能及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期在苦瓜傷流液的開發(fā)領(lǐng)域取得創(chuàng)新性研究成果，也可為其他植物傷流液的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

健康ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(25±2)g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK蘇2007-0001)。

新鮮MBS 江蘇揚(yáng)中苦瓜種植基地；鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司；二甲雙胍 上海華氏制藥有限公司；血糖測定試紙 美國強(qiáng)生公司；肝糖原、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；胰島素放射免疫測定試劑盒 北京科美生物技術(shù)有限公司。

TOUCHI血糖監(jiān)測儀 美國強(qiáng)生公司；BR4i冷凍離心機(jī) 法國Jouan公司；GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司；Leica DM2500顯微鏡 易微科技有限公司；T8電動(dòng)勻漿器 德國IKA公司；B040234全自動(dòng)酶標(biāo)儀 Thermo公司；UV-2100分光光度計(jì) 尤尼科(上海)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MBS的收集

取苦瓜采摘后的苦瓜藤莖，傍晚時(shí)分，在距地面80cm左右將苦瓜藤莖剪斷，并將其插入接收瓶中，塞緊瓶口，綁扎固定，次日傍晚每株可接收到450mL左右的MBS原液。收集的液體經(jīng)過濾，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 MBS干粉的制備

新鮮MBS→離心去雜質(zhì)→低溫真空濃縮→冷凍干燥→MBS凍干粉

1.2.3 STZ糖尿病小鼠模型的建立

健康ICR雄性小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，第1組10只為正常對(duì)照組，第2組50只為造模組。造模時(shí)小鼠禁食不禁水16～17 h后，按170mg/(kg bw·d)腹腔注射STZ溶液(STZ臨用前用檸檬酸緩沖液冰浴避光配制成質(zhì)量濃度為1g/100mL的溶液)[11]。適應(yīng)性喂養(yǎng)72h后禁食3～5h，斷尾取血測血糖值，血糖值在11.1mmol/L以上的為高血糖造模成功小鼠[12]。

1.2.4 MBS對(duì)STZ糖尿病小鼠的降血糖實(shí)驗(yàn)

以正常小鼠作為正常對(duì)照組，將STZ誘導(dǎo)成功的糖尿病小鼠按平均血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組和MBS組。正常對(duì)照組和模型組每天灌胃0.4mL生理鹽水，二甲雙胍組、MBS組按200mg/(kg bw·d)分別灌胃二甲雙胍和MBS，各組實(shí)驗(yàn)均連續(xù)灌胃30d。末次灌胃后禁食3～5h，斷尾取血測血糖值；次日，采用摘眼球取血并分離血清測胰島素、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白含量；取肝臟測肝糖原含量；每組隨機(jī)取3只小鼠的胰腺用甲醛固定、石蠟包埋和HE染色，做組織切片觀察。各指標(biāo)測定參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBS對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

表1 MBS對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of MBS on body weight in diabetic mice

由表1可知，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，灌胃30 d后，正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯增加，而模型組出現(xiàn)消瘦癥狀，體質(zhì)量增加緩慢； MBS組與模型組相比，體質(zhì)量增長速度明顯加快，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果顯示，MBS對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量減輕有一定的改善作用。

2.2 MBS對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

灌胃前各組小鼠血糖值與正常對(duì)照組小鼠相比，顯示極顯著差異，證明STZ成功誘導(dǎo)了小鼠的高血糖。灌胃30d后，正常對(duì)照組小鼠血糖維持穩(wěn)定，模型組小鼠血糖略有升高；與模型組相比，二甲雙胍組與MBS組血糖值均顯著降低，具有極顯著差異(P＜0.01)，表明MBS可降低糖尿病小鼠空腹血糖值，且降糖效果與二甲雙胍相似(表2)。

表2 MBS對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響Table 2 Effect of MBS on fasting plasma glucose level in diabetic mice

2.3 MBS對(duì)糖尿病小鼠肝糖原含量的影響

與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠肝糖原含量明顯降低，說明糖尿病小鼠糖代謝出現(xiàn)紊亂，肝糖原合成量下降。與模型組相比，二甲雙胍組和MBS組肝糖原含量均顯著升高(P＜0.05)，且MBS組的肝糖原含量高于二甲雙胍組。結(jié)果說明MBS具有改善糖尿病小鼠糖代謝紊亂、增加肝糖原合成的功能(圖1)，從而使血糖下降。

圖1 MBS對(duì)糖尿病小鼠肝糖原含量影響Fig.1 Effect of MBS on the content of hepatic glycogen in diabetic mice

2.4 MBS對(duì)糖尿病小鼠血脂水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)極顯著升高(P＜0.01)，而高密度脂蛋白(HDL-C)則極顯著降低(P＜0.01)，具有高脂血癥的顯著特征。灌胃MBS與二甲雙胍后，其高脂血癥有不同程度的緩解，尤其是MBS組，基本達(dá)到正常組的水平，說明MBS對(duì)糖尿病所引起的高脂血癥有顯著的改善作用(表3)。

表3 MBS對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響Table 3 Effect of MBS on blood-fat in diabetic mice

2.5 MBS對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響

STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清胰島素水平較正常組相比極顯著下降(P＜0.01)。 灌胃30d后，與糖尿病模型組比較，二甲雙胍組胰島素含量略有增加，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上未達(dá)到顯著差異(P＞0.05)，而MBS組胰島素含量則顯著上升(P＜0.05)，表明MBS能促進(jìn)糖尿病小鼠分泌胰島素，且效果優(yōu)于二甲雙胍(圖2)。

圖2 MBS對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響Fig.2 Effect of MBS on the content of serum insulin in diabetic mice

2.6 MBS對(duì)糖尿病小鼠胰島組織及胰島β細(xì)胞的作用

圖3 MBS對(duì)糖尿病小鼠胰島組織形態(tài)的影響(×100)Fig.3 Effect of MBS on the morphology of pancreas islet tissues in diabetic mice (×100)

顯微鏡下觀察小鼠胰島組織切片發(fā)現(xiàn)，正常組胰島結(jié)構(gòu)清晰，邊緣界限整齊，細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核大小均一，內(nèi)、外分泌部之胰島β細(xì)胞數(shù)目無增多或減少，腺泡上皮無變性壞死(圖3A)；模型組小鼠胰島組織邊緣不甚清晰，大部分細(xì)胞核皺縮變形，內(nèi)、外分泌部之胰島β細(xì)胞數(shù)目減少，胰腺細(xì)胞部分呈脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(圖3B)；二甲雙胍組胰島體積較小，整體形態(tài)與模型組相比無明顯變化(圖3C)；MBS組與模型組相比，胰島結(jié)構(gòu)較清晰，邊緣界限較完整，胰島β細(xì)胞數(shù)目減少程度明顯改善，腺泡上皮無變性壞死(圖3D)。

3 討 論

STZ通過自由基損傷胰島β細(xì)胞，使其胰島素合成減少，誘發(fā)糖尿病[13]。實(shí)驗(yàn)小鼠在注射STZ 72h后，與正常組相比血糖升高顯著，并出現(xiàn)“三多一少”的糖尿病癥狀。灌胃MBS 30d后，糖尿病小鼠血糖明顯下降(P＜0.01)，且小鼠體質(zhì)量也有一定的增加。

肝臟是動(dòng)物糖代謝的主要器官之一，可通過糖異生和肝糖原的合成與分解來調(diào)節(jié)血糖的濃度[14]。結(jié)果顯示，二甲雙胍組和MBS組小鼠的肝糖原含量均顯著增加(P＜0.05)，說明MBS具有改善其異常糖代謝的功能。

TC、TG是高脂血癥的重要指標(biāo)，是心血管疾病的危險(xiǎn)因子。HDL-C是心血管的保護(hù)因子，能將膽固醇和甘油三酯送入肝臟代謝，因此被譽(yù)為血管的清道夫[15-16]。STZ糖尿病小鼠在高血糖的同時(shí)，還伴隨脂代謝紊亂[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MBS能顯著降低STZ糖尿病小鼠血清中TC、TG 含量，且增加HDL-C含量(P＜0.01)，說明MBS還具有調(diào)節(jié)STZ糖尿病小鼠脂代謝的作用。

胰島素是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的激素，對(duì)保持機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝平衡、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。實(shí)驗(yàn)表明，MBS能提高STZ糖尿病小鼠血清胰島素水平(P＜ 0.05)，且對(duì)STZ造成的胰島β細(xì)胞損傷有明顯的修復(fù)作用，而二甲雙胍對(duì)STZ糖尿病小鼠血清胰島素水平及胰島組織修復(fù)則無明顯作用。結(jié)果提示，MBS的降血糖作用與胰島組織修復(fù)有關(guān)，而二甲雙胍則與胰島組織修復(fù)無關(guān)，說明二者在降糖機(jī)制上存在差異。

綜上所述，MBS能顯著降低STZ糖尿病小鼠的空腹血糖值，增加其肝糖原、血清胰島素和高密度脂蛋白含量，并降低血脂含量。組織切片顯示，MBS能夠改善胰島組織形態(tài)，促進(jìn)胰島細(xì)胞的修復(fù)，其降糖機(jī)制與促進(jìn)肝糖原合成、調(diào)節(jié)脂代謝、改善胰島組織功能、促進(jìn)胰島β細(xì)胞修復(fù)及增加胰島素分泌相關(guān)。

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Antihyperglycemic Function ofMomordica charantiaL. Bleeding sap in STZ-Induced Diabetic Mice

DONG Ying1，ZHU Jing-ying1，CHEN Jun2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

R151.2

A

1002-6630(2010)21-0349-04

2010-03-02

江蘇省鎮(zhèn)江市科技攻關(guān)項(xiàng)目(NL2008019)

董英(1954—)，女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：ydong@ujs.edu.cn