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    可降解L-蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選及鑒定

    2010-10-19 05:25:48王立芳文連奎
    食品科學(xué) 2010年21期
    關(guān)鍵詞:降酸伊薩蘋果酸

    王立芳,張 微,文連奎*

    (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

    可降解L-蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選及鑒定

    王立芳,張 微,文連奎*

    (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

    從葡萄園土壤中分離得到一株可降解L-蘋果酸和檸檬酸的菌株,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行降酸能力實(shí)驗(yàn),測(cè)得該菌株對(duì)12g/L的L-蘋果酸和檸檬酸的降解率分別達(dá)到93.17%和92.08%。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及rDNA-ITS(internal transcribed spacer,內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析,鑒定該菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I.terricola)。對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其最適生長(zhǎng)溫度為30℃,最適生長(zhǎng)pH值為2.0~5.5。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代,其降酸性能和生長(zhǎng)特性仍較穩(wěn)定。

    降解;L-蘋果酸;檸檬酸;篩選;鑒定

    Abstract:A strain (named S8) degrading bothL-malic acid and critic acid was isolated from the soil of the wineyard in Jilin Agricultural University. The abilities of this strain to degrading 12 g/LL-malic acid and critic acid solutions were measured, and deacidification rate was 93.17% forL-malic acid and 92.08% for critic acid. Based on the morphological, physiological and biochemical identification and the rDNA-ITS (internal transcribed spacer) sequence analysis, this stain was classified asIssatchenkia terricola. The investigation of its biological characteristics showed that the optimal temperature and pH for its growth were 30 ℃ and 2.0-5.5, respectively. After passaging of 10 generations, the acid-degrading ability and growth characteristics of this strain were still stable.

    Key words:degradation;L-malic acid;critic acid;screening;identification

    L-蘋果酸又名L-2-羥基丁二酸,主要存在于蘋果、葡萄和不成熟的山楂等果實(shí)中[1];檸檬酸又名枸櫞酸,主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、山楂等果實(shí)中[2];目前均在食品、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域[3-4]廣泛應(yīng)用。但是用含酸量高的果實(shí)生產(chǎn)的果酒會(huì)有酸澀感、品質(zhì)下降[5-7];此外,L-蘋果酸和檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)排放的廢棄物酸度太高,對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染,必須進(jìn)行降酸才能達(dá)到國(guó)家規(guī)定的排放標(biāo)準(zhǔn)[8],因此,在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)L-蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行降解具有重要意義。

    目前關(guān)于蘋果酸降酸微生物的報(bào)道主要是粟酒裂殖酵母和乳酸菌。粟酒裂殖酵母發(fā)酵能力較弱,且會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕禰9]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵在實(shí)際生產(chǎn)中操作不易控制,且乳酸菌易引起果酒的多種病害[10]。近年來(lái),科學(xué)家致力于降酸基因克隆方面的研究[11-12],取得了很大成就,但仍有不少問題有待于進(jìn)一步研究。利用微生物降解檸檬酸的報(bào)道還很少,趙玉平等[13]以檸檬酸為唯一碳源,篩選到一株能有效降解山楂汁中檸檬酸的菌株。在目前的研究中,尚未見報(bào)道能同時(shí)對(duì)L-蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行降解的微生物,本研究從葡萄園土壤中篩選既能降解L-蘋果酸又能降解檸檬酸的菌株,旨在為L(zhǎng)-蘋果酸或檸檬酸的降解提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 采樣

    土壤樣品取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    富集培養(yǎng)基(WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基):酵母浸粉0.4g、胰蛋白胨 0.5g、KH2PO40.055g、KCl 0.0425g、無(wú)水CaCl20.0125g、FeCl30.00025g、MgSO40.0125g、MnSO40.00025g、L-蘋果酸按需加入,蒸餾水100mL;分離培養(yǎng)基(WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基):酵母浸粉0.4g、胰蛋白胨0.5g、KH2PO40.055g、KCl 0.0425g、無(wú)水CaCl20.0125g、FeCl30.00025g、MgSO40.0125g、MnSO40.00025 g、瓊脂2g、L-蘋果酸按需加入,蒸餾水100mL,L-蘋果酸配成溶液與其他培養(yǎng)液分別滅菌后混合倒平板;保藏培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基;菌落形態(tài)觀察用培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;生理生化鑒定用各培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[14]方法制備。

    1.1.3 試劑及試劑盒

    L-蘋果酸(分析純) Bio Basic 公司;檸檬酸(分析純)北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司;AxyPrep基因組DNA小量抽提試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;DNA MarkerDL2000、引物ITS1和ITS4、即用PCR擴(kuò)增試劑盒、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒 上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 降酸菌的篩選與分離

    富集:將土壤加入無(wú)菌生理鹽水充分振蕩,取適量靜置后的上清液加入到以L-蘋果酸為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中,30℃,150r/min培養(yǎng)24h后,移取適量菌液轉(zhuǎn)接入L-蘋果酸質(zhì)量濃度4g/L新鮮富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)轉(zhuǎn)接5次,同時(shí)L-蘋果酸質(zhì)量濃度由4、6、8、10g/L逐漸遞增到12g/L。

    篩選:取適量富集菌液,用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選擇10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度,分別吸取50μL稀釋液涂布于L-蘋果酸質(zhì)量濃度為 12g/L的分離平板培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板,30℃倒置培養(yǎng)48h。

    分離純化:將篩選得到的單菌落用涂布平板法進(jìn)行多次分離純化,獲得的純化菌株再分別接種到以檸檬酸為唯一碳源的WL培養(yǎng)基中培養(yǎng),測(cè)定各菌株對(duì)檸檬酸的降解能力。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后,測(cè)定其對(duì)L-蘋果酸和檸檬酸降解的穩(wěn)定性。

    酸度測(cè)定采用高效液相色譜法[15],降酸率以L-蘋果酸或檸檬酸降酸前后的質(zhì)量濃度差與降酸前質(zhì)量濃度的百分比表示。

    1.2.2 降酸菌的形態(tài)及生理生化鑒定

    對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定,具體方法參照《真菌鑒定手冊(cè)》[16]。

    1.2.3 降酸菌的分子生物學(xué)鑒定

    參照文獻(xiàn)[17]方法對(duì)菌株的5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行分析。

    1.2.3.1 總DNA提取

    利用AxyPrep基因組DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行總DNA的提取。

    1.2.3.2 PCR擴(kuò)增

    5.8 S rDNA-ITS序列擴(kuò)增引物采用真菌通用引物[18],上游引物為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,下游引物為ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系為:雙蒸水22μL,2×PCR Master 25μL,引物ITS1 和ITS4(20μmol/L)各1μL,模板DNA 1μL。擴(kuò)增條件:94℃ 10min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

    1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)、純化與測(cè)序

    擴(kuò)增完畢后,取5μL的PCR產(chǎn)物與1μL 6×Loading buffer混合,加樣于1.0%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳。電泳后,在紫外透射儀下進(jìn)行檢測(cè),若擴(kuò)增成功,則有亮帶出現(xiàn)。產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10柱式回收試劑盒回收純化后由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

    1.2.3.4 同源性分析

    將ITS序列與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行Blast比對(duì)分析,找出與目的基因序列同源性最高的菌株,確定菌株的種類。

    1.2.4 降酸菌的生長(zhǎng)特性

    用WL培養(yǎng)基,設(shè)置不同水平的溫度(24~34℃,pH5.0)、pH值(1.5~6.0,最適溫度),于150r/min振蕩培養(yǎng)48h。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm值,分析兩因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代后,以同樣方法測(cè)定其生長(zhǎng)特性的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 降酸菌的降酸能力

    將分離純化得到的菌株進(jìn)行降酸能力實(shí)驗(yàn),得到一株對(duì)L-蘋果酸和檸檬酸降解能力都很強(qiáng)的菌株,命名為S8。以1%的接種量將菌濃度為2×107CFU/mL的S8菌株依次接種于含有4、6、8、10、12、14、16、18、20g/L的L-蘋果酸(檸檬酸)為唯一碳源的WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,150r/min振蕩培養(yǎng)48h后測(cè)定其對(duì)不同質(zhì)量濃度L-蘋果酸(檸檬酸)的降解率,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度L-蘋果酸和檸檬酸的降解率Fig.1 Degradation rates of strain S8 to different concentrations ofL-malic acid and critic acid

    由圖1可見,在4~12g/L范圍內(nèi),菌株對(duì)L-蘋果酸和檸檬酸的降解能力相差不大;當(dāng)超過(guò)12g/L時(shí),菌株對(duì)L-蘋果酸的降解能力變化不大,但對(duì)檸檬酸的降解能力卻明顯減弱,這說(shuō)明檸檬酸質(zhì)量濃度大于12g/L時(shí),已不利于降酸酶發(fā)揮作用,L-蘋果酸則對(duì)其影響不大。菌株對(duì)12g/L的L-蘋果酸和檸檬酸的降解率分別達(dá)到93.17%和92.08%,其對(duì)12g/L以下的檸檬酸和20g/L以下的L-蘋果酸降解率均達(dá)80%以上。經(jīng)傳代培養(yǎng)10代后,測(cè)得其降酸性能仍較穩(wěn)定。

    2.2 降酸菌的形態(tài)及生理生化特性鑒定

    圖2 S8菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain S8 cultured on PDA medium

    菌株在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖2所示,菌落為乳白色,呈圓形,大而厚,菌落質(zhì)地均勻,表面光滑、濕潤(rùn)、黏稠,容易挑起,邊緣整齊,中間稍微凸起,不透明,有面包發(fā)酵氣味。細(xì)胞形態(tài)如圖3所示:細(xì)胞呈橢圓形,繁殖方式為多邊出芽生殖。

    圖3 細(xì)胞形態(tài)觀察(×400)Fig.3 Cell morphology of strain S8 (×400)

    表1 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and bicochemical properties of strain S8

    對(duì)S8菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表1所示。菌株發(fā)酵葡萄糖既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣,發(fā)酵D-木糖、乳糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,發(fā)酵甘露醇既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,能利用油脂、檸檬酸鹽、硝酸鹽,具有H2O2活性,不能水解淀粉,不能液化明膠,分解葡萄糖不產(chǎn)生有機(jī)酸和乙酰甲基甲醇,不能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚,對(duì)氨基酸沒有脫氨和脫羧作用,分解含硫氨基酸或無(wú)機(jī)硫化物不釋放SO2,不具有氧化酶活性。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[19],S8菌株的形態(tài)特征和生理生化特征與陸生伊薩酵母(I.terricola)幾乎完全相同。

    2.3 分子生物學(xué)鑒定

    2.3.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與序列測(cè)定

    圖4 菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electropherogram of PCR product of strain S8

    將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,在紫外燈照射下觀察結(jié)果如圖4所示,樣品條帶出現(xiàn)在250bp和500bp之間,大小為400bp左右。

    2.3.2 同源性分析

    將菌株的5.8S rDNA-ITS序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行Blast比對(duì)分析,同源性超過(guò)99%的菌株如表2所示。

    表2 5.8S rDNA-ITS序列基因組相似菌株Table 2 Analysis of homology amongIssatchenkiastrains based on 5.8S rDNA-ITS sequence

    由表2可見,與菌株同源性超過(guò)99%的菌株均為陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola),由此鑒定S8菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I. terricola)(Genbank登錄號(hào)為HM355830)。

    2.4 降酸菌的生長(zhǎng)特性

    2.4.1 最適生長(zhǎng)溫度

    由圖5可知,培養(yǎng)溫度在26~34℃時(shí),S8菌株均可生長(zhǎng),但30℃時(shí)菌體生物量最大,因此選擇30℃為S8菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

    圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of culture temperature on growth of strain S8

    2.4.2 最適生長(zhǎng)pH值

    圖6 培養(yǎng)液pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of medium pH on growth of strain S8

    由圖6可知,在pH2~5.5范圍內(nèi)菌體數(shù)量較多且相差不大,而在pH<2和pH>5.5時(shí)菌體數(shù)量均開始減少,因此選擇最適生長(zhǎng)pH值為2~5.5。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后,其生長(zhǎng)特性仍較穩(wěn)定。

    3 結(jié) 論

    經(jīng)過(guò)富集、篩選、分離純化,得到一株既能降解L-蘋果酸又能降解檸檬酸的菌株,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征及5.8S rDNA-ITS序列分析,鑒定該菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)陸生伊薩酵母種(I. terricola)。通過(guò)降酸能力測(cè)定,其對(duì)12g/L以下的檸檬酸和20g/L以下的L-蘋果酸降解率均達(dá)80%以上。對(duì)該菌株生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究,其最適生長(zhǎng)溫度為30℃,最適生長(zhǎng)pH值為2.0~5.5。

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    Screening and Identification of a Strain DegradingL-Malic Acid and Critic Acid

    WANG Li-fang,ZHANG Wei,WEN Lian-kui*
    (College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

    Q93.331

    A

    1002-6630(2010)21-0279-04

    2010-07-05

    吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(20090228)

    王立芳(1984—),女,碩士研究生,主要從事食品微生物及生物技術(shù)研究。E-mail:lifang9110@163.com

    *通信作者:文連奎(1962—),男,教授,博士,主要從事長(zhǎng)白山野生資源的開發(fā)利用研究。E-mail:wenliankui@163.com

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