利用熒光假單胞菌固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸

陳 萍，苗曉燕，張?bào)忝?，?強(qiáng)，孫文敬,3,*

(1.保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000；2.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

利用熒光假單胞菌固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸

陳 萍1，苗曉燕1，張?bào)忝?，周 強(qiáng)2，孫文敬2,3,*

(1.保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000；2.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

以海藻酸鈉為載體固定熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4，考察固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的條件。結(jié)果表明：利用5.0%海藻酸鈉制備的固定化細(xì)胞顆粒穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用7次；發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的最適質(zhì)量濃度為0.75g/100mL，固定化細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度為30～36℃；在適宜的培養(yǎng)條件下，固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率基本相同，分別可達(dá)13.5g/100mL和90.0%左右。

固定化細(xì)胞；熒光假單胞菌；2-酮基-D-葡萄糖酸；海藻酸鈉；發(fā)酵

Abstract：The cells ofPseudomonas fluorescensAR4 were immobilized by sodium alginate, and the optimization of fermentation conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells were investigated. The results showed that 5.0% of sodium alginate was the optimal carrier for immobilizingPseudomonas fluorescensAR4 to give a high yield, and the immobilized cells could be reused for 7 times. The optimal concentration of corn steep liquor in fermentation medium was 0.75 g/100 mL, and fermentation temperature was between 30 ℃ and 36 ℃. Under the optimal conditions, immobilized cells and free cells could give similar yield and conversion rate of 13.5 g/100 mL and 90.0%, respectively.

Key words：immobilized cell；Pseudomonas fluorescens；2-keto-D-gluconic acid；sodium alginate；fermentation

固定化細(xì)胞技術(shù)是保持生物催化劑穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其使用壽命、增加生產(chǎn)能力的重要手段[1]。固定化細(xì)胞的制備方法主要有吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法及包埋法等4類[2]。其中，包埋法是研究與生產(chǎn)中最常用的細(xì)胞固定化方法，具有方法簡(jiǎn)單、條件溫和、穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度較高等優(yōu)點(diǎn)[3]。海藻酸鈉是包埋法常用的載體之一，固化成形方便，對(duì)微生物毒性小，以其制備的固定化細(xì)胞密度高[4]，因此在細(xì)胞固定化中得到了廣泛使用。目前有關(guān)固定化細(xì)胞在發(fā)酵工程中的應(yīng)用研究較多[5-10]，但關(guān)于利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)的研究報(bào)道較少。

2KGA是生產(chǎn)食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及D-異抗壞血酸鈉的前體，工業(yè)上通常采用細(xì)菌發(fā)酵的方法由D-葡萄糖轉(zhuǎn)化而來[11-12]。我國(guó)是目前國(guó)際上最大的2KGA生產(chǎn)國(guó)，生產(chǎn)規(guī)模達(dá)到了50000t/年，但在發(fā)酵生產(chǎn)中仍存在著能源消耗大、產(chǎn)物提取率不高、發(fā)酵菌體沒有得到充分利用等問題[13]。本研究探索利用固定化細(xì)胞進(jìn)行2KGA的發(fā)酵生產(chǎn)，以達(dá)到盡可能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵菌體的循環(huán)利用、有效提高發(fā)酵產(chǎn)物純度的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4是以熒光假單胞菌A46為親株誘變選育的抗噬菌體菌株[14]。

海藻酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。培養(yǎng)基(g/L)：斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、瓊脂20.0、pH7.0；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.0、玉米漿10.0、尿素 2.0、KH2PO42.0、MgSO4·7H2O 0.5、pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖140.0、玉米漿10.0、CaCO345.0、pH6.7。

752型分光光度計(jì) 天津拓普儀器有限公司；SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；WZZ-1SS數(shù)字式自動(dòng)旋光儀 上海精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固定化細(xì)胞的制備

游離細(xì)胞的培養(yǎng)及菌懸液的制備：將活化的斜面菌種分別接種于若干裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)20h。取100mL種子培養(yǎng)液4000r/min離心20min，收集濕菌體。用生理鹽水洗滌濕菌體兩次，再用生理鹽水將其制成0.25g/mL的菌懸液(約5×108cells/mL)。

固定化細(xì)胞的制備：按1:1的比例，將菌懸液分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的海藻酸鈉溶液混合均勻。然后用無菌注射器將混合液緩慢滴入0.05 mol/L的CaCl2溶液中，形成直徑約2.5mm的固定化細(xì)胞顆粒。待固定化細(xì)胞顆粒穩(wěn)定成型后，用生理鹽水洗滌兩次備用。

1.2.2 固定化細(xì)胞的增殖培養(yǎng)

將一定量的固定化細(xì)胞(用2mL的菌懸液制備)加入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃增殖培養(yǎng)20h。增殖結(jié)束后，用蒸餾水充分洗滌固定化細(xì)胞。

1.2.3 固定化細(xì)胞的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將上述增殖的固定化細(xì)胞加入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.4 固定化細(xì)胞的重復(fù)利用

發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中過濾分離固定化細(xì)胞，并用蒸餾水充分洗滌其表面殘留物，然后將其重新加入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.5 游離細(xì)胞的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將2mL的菌懸液接入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.6 測(cè)定方法

1.2.6.1 發(fā)酵液中游離細(xì)胞生長(zhǎng)量(OD690nm值)的測(cè)定

用0.2mol/L的HCl稀釋發(fā)酵液20倍，以水作空白，用752型分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)690nm處的光密度，比色杯的光程為1cm。

1.2.6.2 發(fā)酵液中2KGA的測(cè)定

采用旋光法測(cè)定[14]。取一定量的2KGA發(fā)酵液，4000r/min離心20min以除去沉淀物。然后，取25mL的離心上清液與20mL的蒸餾水混合，攪動(dòng)下用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5～1.6，再在60℃水浴中保溫30min。用冷水將其冷卻至25℃并用蒸餾水定容到100mL，再于4000r/min離心30min，所得上清液作為樣品溶液。25℃條件下，測(cè)定樣品溶液的旋光度及其葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)下式計(jì)算發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度。

式中：Y為發(fā)酵液的旋光度/(°)；X1為發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度/(g/100mL)；X2為發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(g/100mL)；－0.88為1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°)；0.5275為1g/100mL葡萄糖溶液的旋光度 /(°)。

1.2.6.3 發(fā)酵液中葡萄糖的測(cè)定

取一定量的2KGA發(fā)酵液，4000r/min離心20min以除去沉淀物。然后，取離心上清液用蒸餾水進(jìn)行適度稀釋，在25℃條件下采用生物傳感分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞固定化效果的影響

表1表明，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，固定化細(xì)胞顆粒的強(qiáng)度明顯增加，可重復(fù)利用次數(shù)增多，有利于固定化細(xì)胞制備成本的降低；但固定化細(xì)胞強(qiáng)度過大，其彈性勢(shì)必有所下降，有礙底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，不利于菌體的生長(zhǎng)和代謝。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小，發(fā)酵液的OD690nm值增大，表明發(fā)酵過程中固定化細(xì)胞的菌體泄露增多，其可重復(fù)利用的次數(shù)減少。綜合考慮，選用5.0%的海藻酸鈉對(duì)熒光假單胞菌AR4進(jìn)行固定化。

表1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞固定化效果的影響Table 1 Effect of sodium alginate concentration on cell immobilization

2.2 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的比較

圖1 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的比較Fig.1 Comparative production of 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells and free cells

由圖1可知，發(fā)酵60h時(shí)，游離細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度已經(jīng)達(dá)到13.30g/100mL，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到88.0%以上，其發(fā)酵已接近終點(diǎn)，而此時(shí)固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度只有10.84g/100mL，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率約為72.0%，說明固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸速率較游離細(xì)胞慢；發(fā)酵72h時(shí)，游離細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度幾乎沒有明顯變化，而固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度明顯增加至13.26g/100mL，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率接近88.0%，說明固定化細(xì)胞具有與游離細(xì)胞相似的生產(chǎn)2KGA的能力。繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，游離細(xì)胞及固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度均無明顯增加，故將發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為72h。

2.3 玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響

圖2 玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)2KGA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of corn steep liquor concentration on 2-keto-D-gluconic acid production

圖2表明，玉米漿質(zhì)量濃度過大或過小均不利于固定化細(xì)胞2KGA的生產(chǎn)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的質(zhì)量濃度為0.75g/100mL時(shí)，固定化熒光假單胞菌AR4的2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率最高。有實(shí)驗(yàn)[15]表明，培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為14.0g/100mL時(shí)，游離細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的最適玉米漿質(zhì)量濃度為1.5g/100mL左右。產(chǎn)生上述差異的原因可能是：固定化細(xì)胞在發(fā)酵前已經(jīng)經(jīng)過增殖，對(duì)氮源的需求量與游離細(xì)胞不同；游離細(xì)胞生長(zhǎng)需要大量氮源，而固定化細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，其氮源主要用于維持自身生理代謝?？傮w上講，利用固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA所需的氮源量相對(duì)較少，有利于節(jié)約成本和發(fā)酵產(chǎn)物提取。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響

發(fā)酵溫度對(duì)2KGA生產(chǎn)具有明顯的影響。發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng)；發(fā)酵溫度過高，產(chǎn)物對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率降低[16]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，采用熒光假單胞菌AR4工業(yè)生產(chǎn)2KGA的發(fā)酵溫度一般控制在33～36℃。本實(shí)驗(yàn)采用玉米漿質(zhì)量濃度為0.75g/100mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，在30～40℃的溫度范圍內(nèi)考察發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on 2-keto-D-gluconic acid production by immobilized cells

圖3結(jié)果表明，隨著發(fā)酵溫度升高，2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率逐漸下降。30～36℃固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率較高，分別達(dá)到13.40～13.60g/100mL和88.78%～90.11%，表明固定化細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度為30～36℃，與游離細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度相近。發(fā)酵溫度升至38℃時(shí)，2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率明顯降低，但仍分別達(dá)到12.87g/100mL和85.31%，說明AR4菌株生產(chǎn)性能穩(wěn)定，產(chǎn)酸溫度范圍廣，具有較好的高溫發(fā)酵能力。

表2 重復(fù)利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Effect of repeated use of immobilized cells on 2-ket-D-gluconic acid production

2.5 固定化細(xì)胞的重復(fù)利用

固定化細(xì)胞被重復(fù)使用7次后，可能受到發(fā)酵液中離子腐蝕效應(yīng)的影響，其機(jī)械強(qiáng)度明顯下降，約有10%～20%的凝膠顆粒出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，表現(xiàn)為發(fā)酵液中的菌體生長(zhǎng)量明顯增加，但其2KGA的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率沒有發(fā)生明顯變化(表2)。

3 結(jié) 論

使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%海藻酸鈉制備的固定化細(xì)胞穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用7次左右；固定化熒光假單胞菌AR4的產(chǎn)酸能力與其游離細(xì)胞基本相同，但產(chǎn)酸速率略低于游離細(xì)胞；固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的適宜溫度為30～36℃，與其游離細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度相近；固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的氮源需求量明顯低于其游離細(xì)胞，有利于生產(chǎn)成本的降低及發(fā)酵產(chǎn)物的提取。

[1] RAFAEL A P, JUAN J M, JOSE M V, et al. Yeast biocapsules:A new immobilization method and their applications[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 40(1):79-84.

[2] 曹永梅. 海藻酸鈉固定化細(xì)胞及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)乳業(yè), 2001, 29(6):34-36.

[3] 羅貴民, 曹淑桂, 張今. 酶工程[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002:57.

[4] EHAB T, MANSOORE A. Enzyme immobilization in novel alginatechitosan core-shell microcapsules[J]. Biomaterials, 2004, 25(10):1937-1945.

[5] 成慶利, 滑冰. 固定化細(xì)胞研究進(jìn)展[J]. 河南教育學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2003, 12(2):53-54.

[6] 王克明, 王宇光. 固定化桔青霉發(fā)酵核酸酶P1的研究[J]. 浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 15(2):90-93.

[7] 黃亞東. 應(yīng)用固定化酵母進(jìn)行啤酒連續(xù)發(fā)酵的研究[J]. 中國(guó)釀造,2001, 20(1):12-15.

[8] 王新惠, 劉玉達(dá). 固定化紅曲霉液體發(fā)酵Lovastain的研究[J]. 釀酒科技, 2010, 31(1):39-43.

[9] 趙艷麗, 胡濱, 劉虎, 等. 固定化發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(9):97-100.

[10] 陳曄, 韓玉潔. 海藻酸鈣法固定化乳酸菌發(fā)酵制備L-乳酸的研究[J].食品工業(yè)科技, 2008, 29(1):98-100.

[11] 孫文敬, 白照熙, 謝紅, 等. 我國(guó)D-異抗壞血酸鈉的研究和生產(chǎn)現(xiàn)狀[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1990, 17(3):170-172.

[12] CHIA M, NGUYEN T B V, CHOI W J. DO-stat fed-batch production of 2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilizedPseudomonas aeruginosa[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(5):759-765.

[13] 孫文敬, 魏轉(zhuǎn), 林琳, 等. 高濃度發(fā)酵及膜分離技術(shù)在2-酮基-D-葡萄糖酸生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17):244-246.

[14] 孫文敬, 楊慶文, 趙峰梅, 等. 2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)生菌熒光假單胞菌A46抗噬菌體菌株的選育[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(7):67-70.

[15] 孫文敬, 楊慶文, 黃惠英, 等. 熒光假單胞菌 AR4產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵條件的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(10):46-49.

[16] 魏轉(zhuǎn), 余泗蓮，孫文敬, 等. 2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2008, 29(8):636-639.

Production of 2-Keto-D-Gluconic Acid Using ImmobilizedPseudomonas fluorescensAR4

CHEN Ping1，MIAO Xiao-yan1， ZHANG Xiao-mei1，ZHOU Qiang2，SUN Wen-jing2,3,*
(1. Department of Biochemistry, Baoding University, Baoding 071000, China；2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China；3. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

TQ814.2

A

1002-6630(2010)21-0258-04

2010-08-27

江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600)；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]147號(hào))

陳萍(1959—)，女，副教授，研究方向?yàn)樯锟茖W(xué)。E-mail：xiaopuchen123@eyou.com

*通信作者：孫文敬(1964—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)樯锘ぁ-mail：sunwenjing1919@163.com