可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

栗 娜，籍保平,*，李 博，吳 薇

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

栗 娜1，籍保平1,*，李 博1，吳 薇2

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

目的：篩選能夠降解咖啡堿的細菌，以期在該毒素的生物脫毒中得到應(yīng)用。方法：以咖啡堿作為唯一碳源和氮源進行咖啡堿降解菌株的初篩，之后將初篩的10株菌通過液體培養(yǎng)基咖啡堿降解實驗最終篩選出降解能力最強的1株菌。結(jié)果：篩選出的HZ-1菌株在48h即可將咖啡堿完全降解，對目標(biāo)菌株細胞形態(tài)、生理生化以及16SrDNA進行鑒定，確定該菌株為Pseudomonas lutea，屬于假單胞菌屬。結(jié)論：利用咖啡堿作為唯一碳源和氮源從土壤中篩選出降解咖啡堿良好的菌株，為脫除咖啡堿提供了微生物菌種，填補了國內(nèi)空白。

咖啡堿；假單胞菌；篩選；鑒定

Abstract：Objective:The aim of this work was to find strains capable of degrading caffeine so as to develop a biological approach for caffeine detoxicification. Method:The preliminary screening of target strains was performed using caffeine as both carbon and nitrogen sources, and then the ten screened strains were further screened by evaluating their abilities to degrade caffeine in liquid medium after culture. As a result, a strain with the strongest ability to degrade caffeine was obtained and named HZ-1.After 48 h culture of HZ-1, caffeine in liquid medium was completely degraded. Based on the morphological, physiological and biochemical properties and 16 rDNA gene sequence, this strain was identified asPseudomonas lutea. To the best of our knowledge,this is the first report on the biological degradation of caffeine at home.

Key words：caffeine；Pseudomonas lutea；screening；identification

咖啡堿(caffeine)又名咖啡因，是一種嘌呤類生物堿，主要分布在咖啡豆、茶葉以及日常飲料中[1-3]。研究表明，高劑量的攝入咖啡堿會影響睡眠，增加血壓，引起頭疼、煩躁、焦慮、易怒、胎兒早產(chǎn)及精細運動功能受損，因此低咖啡因產(chǎn)品越來越受到消費者的歡迎[4-7]。目前脫咖啡堿技術(shù)主要有水脫除法[8]、溶劑萃取法[9]、吸附分離法[10]、超臨界CO2萃取法[11]以及微生物法[12]，前幾種方法脫除率不高且費時費力，還有可能造成環(huán)境污染，而微生物法因其降解效率高、安全無毒等優(yōu)點得到了越來越多學(xué)者的青睞。20世紀(jì)70年代早期，就有利用細菌把咖啡堿作為有毒物質(zhì)降解的報道，這是關(guān)于微生物降解咖啡堿的最早研究[13]。后來Gokulakrishnan等[14]從土壤中篩選出Pseudomonassp. GSC 1182菌株可以利用咖啡堿作為唯一碳源和氮源，該菌株在48h內(nèi)就可以降解掉基礎(chǔ)培養(yǎng)基中80%的咖啡堿，而加入5g/L的蔗糖可以使菌株在36～40h內(nèi)的降解率達到100%。Brand等[15]發(fā)現(xiàn)曲霉菌和青霉菌等真菌類微生物在25℃下可100%降解咖啡堿，而在30℃下其降解效率卻只有30%。目前，在關(guān)于微生物法降解咖啡堿的研究方面，歐美以及日本和印度等國家均取得了進展，但是我國微生物降解咖啡堿方面尚屬空白。本研究旨在使用安全、特異性高的方法高效篩選出降解咖啡堿的菌株并對其進行鑒定，為脫除咖啡堿提供微生物菌種，以填補國內(nèi)空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從杭州茶園、云南茶園、福建茶園和湖北茶園分別收集不同深度的土壤樣品(0、15、30cm)共12份。

咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度不低于99%) 天津市光復(fù)精細化工研究所；細菌DNAout試劑盒 Azygen公司。

咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基(g/L)[14]：Na2HPO40.12、K2HPO41.3、MgSO4·7H2O、CaCl20.3、咖啡堿1.2、pH5.5，121℃，滅菌15min；咖啡堿固體篩選培養(yǎng)基：在MHA培養(yǎng)基(牛肉浸粉5g/L、酪蛋白水解物17.5g/L、淀粉1.5g/L、瓊脂12.5g/L)上添加咖啡堿1.2g/L，121℃，滅菌15min。

1.2 儀器與設(shè)備

Citra6紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC公司。

1.3 方法

1.3.1 降解咖啡堿菌株的分離純化和初篩

無菌操作方法稱取1g土壤樣品，加入到含50mL無菌咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖勻，30℃搖床培養(yǎng)，調(diào)整轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)48～72h。培養(yǎng)液于3000×g離心30min，取2.5mL上清液，加入到50mL無菌咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基里培養(yǎng)，為避免細菌原環(huán)境中的碳源干擾，共需3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。3代培養(yǎng)后，取0.5mL菌液用無菌水梯度稀釋，稀釋級數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，采用咖啡堿固體篩選培養(yǎng)基進行基內(nèi)接種，稀釋涂布法，每個稀釋度做3個平行，兩次重復(fù)，30℃倒置培養(yǎng)。菌落長出后，挑取單菌落在固體篩選培養(yǎng)基平板上劃線分離，30℃倒置培養(yǎng)24～36h。挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢無雜菌后，轉(zhuǎn)接在菌種保存培養(yǎng)基制成的斜面上培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24～36h，于4℃冰箱保存。將純化的菌株分別接種咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基中，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)48h，比較其OD600nm菌體生長量，初步篩選出可利用咖啡堿的菌株。

1.3.2 降解咖啡堿菌株的復(fù)篩

將初篩得到的10株菌分別接種于種子培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)12h，調(diào)整種子液的菌數(shù)為108CFU/mL，以2%的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)48h，以不接種的空白組作為對照。發(fā)酵前后培養(yǎng)液在3000×g離心30min，取上清液在波長273nm處測定其紫外吸收值，根據(jù)吸光度查咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，對發(fā)酵前后咖啡堿的含量進行測定和比較。計算各菌株的咖啡堿降解率，篩選出降解能力最強的1株菌。

1.3.3 發(fā)酵液中咖啡堿含量的測定

咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0、1、2、3、4、5、6mL咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)液于25mL容量瓶，加水稀釋至刻度，混勻，每個濃度分別作3個平行。用10mm石英比色皿，在波長273nm處，以試劑空白作參比，測定吸光度。將測得的吸光度與對應(yīng)的咖啡堿質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=50.0673x－0.0006，R2=0.9999。

咖啡堿降解率采用以下公式計算：

式中：a為初始咖啡堿質(zhì)量濃度/(g/L)；b為剩余咖啡堿質(zhì)量濃度/(g/L)；y為咖啡堿降解率/%。

1.3.4 菌株的鑒定

菌落及菌株形態(tài)觀察：在MHA培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)36h后觀察菌落形態(tài)、色澤，革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細胞形狀。

生理生化性質(zhì)的測定[16]：主要是惟一碳源、接觸酶、氧化酶、過氧化氫酶、卵磷脂降解、硝酸鹽還原和溫度耐受等實驗。

細菌16S rDNA 基因序列測定：1)基因組DNA 的提取。使用AXYGEN細菌基因組DNA小量試劑盒提取菌株全基因組DNA；2)16S rDNA純化、擴增、測序，引物：27f：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；1492r：5＇-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇，純化、擴增、測序由北京華大基因有限責(zé)任公司完成；3)數(shù)據(jù)處理。測序結(jié)果在NCBI 使用Blast 比對，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16S rDNA 同源的公認標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，使用Clustal X 1.8 對齊后使用MEGA 2.1 計算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解咖啡堿菌株的初篩

表1 降解咖啡堿菌株的初篩結(jié)果Table 1 Results of preliminary screening for strains capable of degrading caffeine

通過初篩得到10株菌，能在以咖啡堿為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基中良好生長(表1)。其中有6株來源于表層土壤(0cm)，4株來源于中層土壤(15cm)，而深層土壤中沒有篩選出可以降解咖啡堿的菌株。這說明降解咖啡堿的菌株多存在于接近表層的土壤，多為好氧菌。同時發(fā)現(xiàn)，HZ-1以及FJ-2菌株的生長速度較快，說明這兩株菌株利用咖啡堿能力較強，細胞可以活躍的進行生長繁殖的代謝。

2.2 降解咖啡堿菌株的復(fù)篩

將初篩得到的10株具有咖啡堿降解能力的菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)12h，然后分別以2%的接種量接到咖啡堿液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，做兩個重復(fù)，同時以不接種的空白組作為對照。取發(fā)酵前后培養(yǎng)液的上清液用紫外分光光度計測定咖啡堿的剩余量，從而計算各菌株的咖啡堿降解率，發(fā)現(xiàn)HZ-1菌株的降解能力最強(表2)。對比表1與表2可以看出，菌株降解咖啡堿的量基本與菌液的OD600nm成正比，即菌液的OD600nm值越高，菌體生長旺盛，咖啡堿的降解量就越大，降解效率越高，反之亦然。實驗最后篩選出HZ-1的降解能力最強，菌株在48h就將咖啡堿完全降解，降解率達到100%。

表2 降解咖啡堿菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 2 Results of repeated screening for strains capable of degrading caffeine

2.3 菌株的鑒定

在MHA培養(yǎng)基上涂布HZ-1菌株，于30℃培養(yǎng)24h，菌株生長良好，菌落形態(tài)如圖2所示，HZ-1菌株為黃色圓形菌落，生長直徑0.5mm左右，菌落邊緣整齊，凸起，不透明，表面濕潤光滑。將菌株在MHA培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h，挑選生長良好的單菌落涂片革蘭氏染色觀察，菌體細胞形態(tài)如圖3所示，顯微鏡下細胞形態(tài)為細小短桿狀，革蘭氏染色陰性。

圖2 HZ-1菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain HZ-1

圖3 HZ-1菌株形態(tài)Fig.3 Cell morphology of strain HZ-1

對HZ-1菌株進行了部分生理生化特征測定，結(jié)果表明該菌能利用葡萄糖、蔗糖和果糖等作為碳源，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性(表3)。參照文獻[17]對革蘭氏陰性好氧菌的闡述并結(jié)合前面對HZ-1菌株細胞形態(tài)的觀察，以及Peix等[18]于對Pseudomonas lutea的描述，初步確定HZ-1菌株屬于假單胞菌屬。

表3 HZ-1菌株生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical properties of strain HZ-1

HZ-1菌株的16S rDNA 在NCBI 使用Blast 比對，結(jié)果表明HZ-1菌株與Pseudomonas lutea同源性最高，同源性99%。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16SrDNA同源的公認標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)，結(jié)合遺傳距離、形態(tài)特征以及生理生化特征，可以確定HZ-1為Pseudomonas lutea，屬于假單胞菌屬。

圖4 HZ-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequence of strain HZ-1

3 結(jié) 論

以咖啡堿作為唯一碳源和氮源進行初篩、復(fù)篩，通過測定對咖啡堿的降解能力，最終獲得降解效果最佳的HZ-1菌株，該菌株在48h降解率為100%。通過菌株形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)分析、16S rDNA測序鑒定確定HZ-1菌株為Pseudomonas lutea，相比目前國際上已報道的菌株具有良好的降解效果，為微生物法降解食品中的咖啡堿提供了參考。

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Screening and Identification of aPseudomonas luteaStrain Capable of Degrading Caffeine

LI Na1，JI Bao-ping1,*，LI Bo1，WU Wei2
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083,China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)21-0218-04

2010-04-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD05A06-Z01)

栗娜(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為功能食品。E-mail：lina8575@gmail.com

*通信作者：籍保平(1958—)，男，教授，碩士，研究方向為功能食品。E-mail：jbp@cau.edu.cn