增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在DH5α大腸桿菌中的表達(dá)

王曉輝

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在DH5α大腸桿菌中的表達(dá)

王曉輝

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

采用PCR技術(shù)從pEGFPpA-CAN克隆載體中擴(kuò)增出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)，插入到pGEM-T easy載體中，構(gòu)建pGT-EGFP重組質(zhì)粒，其中的SP6啟動子可用來表達(dá)EGFP蛋白。攜帶pGT-EGFP重組載體的DH5α大腸桿菌較普通DH5α大腸桿菌菌液略帶淡綠色，在熒光顯微鏡下能夠清晰觀察該大腸桿菌的形態(tài)，帶有綠色熒光。同時超聲裂解攜帶pGT-EGFP重組載體的DH5α大腸桿菌，提取菌體總蛋白，SDS-PAGE顯示EGFP蛋白是以可溶性蛋白形式存在的，分子質(zhì)量大約為30kD，與其理論值大小一致。

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；pGEM-T easy；DH5α大腸桿菌

Abstract：To construct a recombinant plasmid (pGT-EGFP), the fragment ofEGFP(enhanced green fluorescent protein) gene was amplified by PCR from the cloning vector pEGFPpA-CAN, and then inserted into the pGEM-T easy vector. The expression of EGFP was regulated by the SP6 promoter in pGEM-T easy. Compared with the culture of DH5αE. coli, the culture of DH5αE. coliwith pGT-EGFPwas a little greener in color. Through fluorescence microscope, the morphological features of DH5αE. coliwith green fluorescence could be clearly observed. Moreover, the extraction of total protein from the lysate of DH5αE. coliwith pGT-EGFPderived from ultrasonic treatment was done. The SDS-PAGE analysis showed that EGFP was a soluble protein, with a molecular weight of approximately 30 kD, which was identical to the theoretical size.

Key words：enhanced green fluorescent protein；pGEM-T easy；DH5αE. coli

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是238個氨基酸組成的單體蛋白，其分子質(zhì)量約為2688D，最初是由Shimomure從多管水母屬(Aequorea victoria)中分離出來的[1]，由Prasher等[2]成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。GFP作為一種報告基因，以其獨特的優(yōu)勢可廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域[3-5]，并于1994年由Chalfie等[6]首次在大腸桿菌和線蟲中表達(dá)了GFP，從此開始了對GFP的研究之路。

GFP已廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選，其篩選效率明顯高于抗生素以及除草劑篩選，并且減少了分子檢測步驟，大大降低了工作量[7]。同時，GFP還可在活體中進(jìn)行檢測，例如Aspuria等[8]通過檢測側(cè)根分生組織GFP熒光的有無來判斷生長素是否在分生組織中成功表達(dá)，擴(kuò)大了GFP的應(yīng)用范圍。

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細(xì)胞中不表達(dá)[9]，因此人們運(yùn)用定點突變等技術(shù)對野生型GFP進(jìn)行了改造。目前應(yīng)用較為廣泛的是增強(qiáng)型 GFP(enhanced green fluorescent protein，EGFP)，它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，而且激發(fā)后16～24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光[10]。

E. coliO157:H7操作不慎易引起生化污染，導(dǎo)致腸出血性腹瀉，同時前人的研究中多使用pCDNA3.1[11]、pGEX[12]、pET30(a)+[13]和 pTWIN1[14]等克隆載體，無研究采用更為普遍的pGEM-T系列載體用于表達(dá)GFP。因此本研究中把EGFP成功克隆到pGEM-T easy載體中，利用其中的SP6啟動子在大腸桿菌DH5α中成功表達(dá)EGFP，從而為進(jìn)一步利用EGFP作為報告基因和篩選標(biāo)記提供參考，為EGFP在食品檢測研究中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pEGFPpA-CAN由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與與營養(yǎng)工程學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室保存；pGEM-T easy Promega公司；pGEM-T7-EGFP，是以T7為啟動子，插入EGFP基因片段的pGEM-T easy重組載體，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與與營養(yǎng)工程學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室保存。

大腸桿菌DH5α 北京全式金有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX51T-32F01-FLB3熒光顯微鏡 Olympus公司；JLH200029紫外燈(365nm波長) JWFU公司。

1.3 方法

1.3.1 克隆載體的構(gòu)建

采用PCR技術(shù)從pEGFPpA-CAN克隆載體中擴(kuò)增出E G F P基因片段。所使用引物為：正向引物：5＇-ACCATGGTGAGCAAGGGCG-3＇；反向引物：5＇-TCGAGCTCGCCCGGCCCGC-3＇。PCR程序設(shè)定為：95℃變性5min；94℃放置30s，60℃放置30s，72℃放置30s，循環(huán)35次；72℃延伸10min。

由于pGEM-T easy克隆載體有兩個EcoR I酶切位點，因此使用EcoRⅠ雙酶切pGEM-T easy克隆載體，與膠回收得到的EGFP基因片段連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，于37℃烘箱環(huán)境Ampr+LB平板上培養(yǎng)12h，篩選陽性克隆。隨機(jī)挑取得到的陽性克隆，37℃于Ampr+LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h，堿裂解法提取質(zhì)粒。使用EcoRⅠ雙酶切鑒定，同時將酶切出目的條帶大小的陽性克隆片段送往上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。得到的包含以SP6為啟動子的讀碼框的重組載體命名為pGT-EGFP。

1.3.2 熒光檢測

取對數(shù)生長期(OD600nm=0.5)的帶有pGT-EGFP的大腸桿菌，用長波長紫外燈365nm和熒光顯微鏡的藍(lán)光激發(fā)大腸桿菌，已轉(zhuǎn)入EGFP基因并且成功表達(dá)EGFP的大腸桿菌受激發(fā)發(fā)出綠色熒光，依次稀釋10倍、100倍和1000倍，采用10%甘油作為固定液，將各個梯度大腸桿菌均勻涂布于載玻片上，小心壓上蓋玻片，防止氣泡生成。熒光顯微鏡下觀察并在400倍的放大倍數(shù)下照相記錄。

1.3.3 蛋白電泳(tricine SDS-PAGE)

含有pGT-EGFP的大腸桿菌37℃條件下生長12h，5000r/min離心收集菌體。將菌體經(jīng)超聲波破碎后與樣品緩沖液(1.21% Tris，0.001%溴酚藍(lán)，2% SDS，10%甘油和5%β-巰基乙醇，pH8.0)充分混合，煮沸10min。

樣品上樣，以80V恒壓進(jìn)行電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入濃縮膠后將電壓升至120V。待溴酚蘭跑至膠的底部，取出凝膠，放在合適大小的平皿中，用染色液(50%甲醇，0.05g/100mL考馬斯亮藍(lán)R-250，10%乙酸)覆蓋凝膠，緩慢搖動1～2h。傾去染色液，以脫色液(7%乙酸，5%甲醇，88%重蒸水)覆蓋凝膠，緩慢搖動約2h，其間更換脫色液3～4次，直至獲得清晰的藍(lán)色條帶及干凈背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組克隆載體鑒定

EGFP基因連接到pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，37℃培養(yǎng)后堿裂解法提取質(zhì)粒(圖1，lane1)，將質(zhì)粒用EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗證，得到約750bp的目的條帶(圖1，lane 2)，同時測序結(jié)果顯示EGFP基因片段成功克隆到pGEM-T easy載體，并且是SP6為啟動子的正確讀碼框。

圖1 EcoR I酶切pGT-EGFPFig.1 Identification of pGT-EGFPplasmid based onEcoR I cleavage

2.2 熒光檢測

2.2.1 菌液檢測

圖2 普通光下拍攝的大腸桿菌DH5αFig.2 Two DH5αE. colistrains with different plasmid vectors under normal light

當(dāng)菌液生長到OD600nm=0.5時，普通光下進(jìn)行拍照，與對照相比，攜帶pGT-EGFP重組質(zhì)粒的大腸桿菌能發(fā)出淡淡的綠色(圖2)。

2.2.2 菌體檢測

當(dāng)菌液生長到OD600nm=0.5時，大腸桿菌DH5α菌體富集后在普通光和365nm波長紫外光下照相，從圖3可以看出，攜帶pGT-EGFP載體的大腸桿菌在長波紫外光下能明顯的發(fā)出綠色熒光，而攜帶pGEM-T7-EGFP載體的大腸桿菌能觀察到微弱的白色。

圖3 普通光和365nm紫外光下拍攝富集后大腸桿菌DH5αFig.3 Two enriched DH5αE. colistrains with different plasmid vectors under normal light and ultraviolet (365 nm)

2.2.3 熒光顯微鏡檢測

在400倍數(shù)放大倍數(shù)下觀察大腸桿菌形態(tài)，將對數(shù)生長期的大腸桿菌稀釋10、100、1000倍以便于觀測，攜帶pGT-EGFP載體的大腸桿菌有清晰形態(tài)并觀察到明顯的綠色熒光(圖4A、B和C)，而攜帶pGEM-T7-EGFP載體的大腸桿菌不能被激發(fā)出綠色熒光(圖4D)。

圖4 熒光顯微鏡下大腸桿菌DH5α形態(tài)(×400)Fig.4 Morphological observations of Two DH5αE. colistrains with different plasmid vectors under fluorescence microscope (×400)

2.3 蛋白電泳

圖5的蛋白電泳結(jié)果顯示，與攜帶pGEM-T easy重組載體的大腸桿菌超聲破碎后其上清液相比，攜帶pGTEGFP載體的大腸桿菌超聲破碎液中，大量表達(dá)一種約30kD的蛋白，而EGFP蛋白理論值是30kD。推斷pGTEGFP重組載體能夠表達(dá)EGFP，并且表達(dá)的EGFP大量存在于超聲破碎大腸桿菌的上清液中，而菌體沉淀中幾乎不存在EGFP，即表達(dá)的EGFP以可溶形式存在于細(xì)胞中。

圖5 超聲破碎后SDS-PAGE檢測大腸桿菌表達(dá)的總蛋白Fig.5 SDS-PAGE of total protein extracted from lysate precipitate and supernatant of two DH5αE. colistrains with different plasmid vectors

3 結(jié) 論

作為良好的標(biāo)記和報告基因，GFP基因應(yīng)用范圍非常廣泛。以往研究體外表達(dá)GFP蛋白通常是把GFP基因克隆到表達(dá)載體pCDNA3.1[11]、pGEX[12]、pET30(a)+[13]以及pTWIN1[14]等，尚無研究采用pGEM-T系列載體用于GFP蛋白表達(dá)，而本研究利用pGEM-T easy克隆載體成功在DH5α高效表達(dá)出EGFP蛋白，為優(yōu)化簡單體外表達(dá)體系建立了模型。

在普通光下，帶有EGFP基因DH5α菌體呈現(xiàn)淡的綠色，肉眼即可分辨，同時手提式長波長紫外燈能快捷準(zhǔn)確的檢測到EGFP蛋白的表達(dá)，這減少了后續(xù)篩選鑒定的工作量，提高了工作效率。在熒光顯微鏡下(×400)，用藍(lán)光照射菌落或菌液，可清晰觀察到EGFP標(biāo)記菌發(fā)出的綠色熒光，從而便于進(jìn)行快速的平板計數(shù)，并可以更好的觀察大腸桿菌各生長時期的形態(tài)。

pGEM-T easy載體有兩個啟動子，T7和SP6。使用T7啟動子需要菌株的染色體上整合有T7RNA聚合酶基因，然而DH5α菌株不帶有T7RNA聚合酶基因，因此只能采用SP6啟動子用來表達(dá)EGFP蛋白。實驗結(jié)果也表明，T7啟動子不能在DH5α菌株中表達(dá)EGFP蛋白。

大腸桿菌進(jìn)行蛋白質(zhì)大量表達(dá)時，常常會造成蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集沉淀，這時候就需要溶解性較好的蛋白與不溶蛋白共表達(dá)，從而增加不溶蛋白的可溶性。pGEM-T easy重組載體pGT-EGFP在DH5α菌株中表達(dá)的EGFP蛋白有很好的溶解性，解決了體外表達(dá)EGFP蛋白質(zhì)聚集沉淀的問題。Pedelacq等[15]利用GFP的這種特性提高了甲基轉(zhuǎn)移酶和NDP激酶的可溶性，而van den Berg等[16]則增加了TEV蛋白酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，同時融合GFP蛋白還能促進(jìn)共表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)域的可溶性[17]。

應(yīng)用pGEM-T easy載體表達(dá)EGFP蛋白的研究已取得初步進(jìn)展，為進(jìn)一步在載體上加入標(biāo)簽序列以在后期方便分離純化EGFP蛋白提供了實驗基礎(chǔ)。但采用長波長紫外燈來進(jìn)行檢測時，干擾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，添加濾光片以消除干擾有待于進(jìn)一步實驗驗證。

趙志晶等[18]將GFP在E. coli O157:H7中表達(dá)，用于食品中大腸桿菌繁殖情況、菌落特性以及食品檢測方法的改進(jìn)，首次將GFP應(yīng)用于食品方面。然而，E. coliO157:H7致病性強(qiáng)，操作不慎易引起生物污染，導(dǎo)致腸出血性腹瀉等疾病，不易作為一般的實驗用菌種。DH5α致病性弱，感受態(tài)也較易獲取，構(gòu)建工程菌用于體外表達(dá)蛋白等物質(zhì)十分便捷，然而其在食品檢測方面的應(yīng)用尚處于起步階段，如何將攜帶pGT-EGFP重組載體的DH5α用于食品檢測，其效果與E. coliO157:H7的差異有待于進(jìn)一步實驗證實，這對食品中大腸桿菌繁殖情況、菌落特性以及食品檢測方法的改進(jìn)具有十分重要的意義。

[1] SHIMOMURA O. Structure of the chromophore ofAequoreagreen fluorescent protein[J]. FEBS Letters, 1979, 104(2):220-222.

[2] PRASHER D C, ECKENRODE V K, WARD W W, et al. Primary structure of theAequorea victoriagreen fluorescent protein[J]. Gene,1992, 111(2):229-233.

[3] KAIN S R, ADAMS M, KONDEPUDI A, et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization[J]. Bio Techniques, 1995, 19(4):650-655.

[4] PHILLIPS G J. Green fluorescent protein-a bright idea for the study of bacterial protein localization[J]. FEMS Microbial Letters, 2001, 204(1):9-18.

[5] 潘求真, 徐曙光, 李佳, 等. 綠色熒光蛋白表達(dá)載體的改造和表達(dá)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2007(1):13-15.

[6] CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Science, 1994, 263(5148):802-805.

[7] VAIN P, WORLAND B, KOHLI A, et al. The green fluorescent protein(GFP) as a vital screen-able marker in rice transformation[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1998, 96(2):164-169.

[8] ASPURIA E T, OOURA C, CHEN G Q, et al. GFP accumulation controlled by an auxin-responsive promoter as a non-destructive assay to monitor early auxin response[J]. Plant Cell Reports, 2002, 21(1):52-57.

[9] HASELOFF J, AMOS B. GFP in plants[J]. Trends in Genetics, 1995,11(8):328-329.

[10] CORMACK B P, VALDIVIA R H, FALKOW S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)[J]. Gene, 1996, 173(1):33-38.

[11] 楊健, 任碧軒, 唐恩潔. 綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[J]. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2005, 20(2):123-125.

[12] 鄭婷. 綠色熒光蛋白的原核表達(dá)、純化以及抗體制備[J]. 氨基酸和生物資源, 2005, 27(1):40-43.

[13] 張少斌, 劉慧. 綠色熒光蛋白的原核表達(dá)、純化與熒光分析[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(6):23-25.

[14] 牛傳雙, 方六榮, 肖少波, 等. 增強(qiáng)型綠熒光蛋白突變體mut4EGFP在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2004, 23(5):489-491.

[15] PEDELACQ J D, CABANTOUS S, TRAN T, et al. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(1):79-88.

[16] van den BERG S, LFDAHL P A, HRD T, et al. Improved solubility of TEV protease by directed evolution[J]. Journal of Biotechnology,2006, 121(3):291-298.

[17] KAWASAKI M, INAGAKI F. Random PCR-based screening for soluble domains using green fluorescent protein[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 280(3):842-844.

[18] 趙志晶, 劉秀梅. 綠色熒光蛋白在大腸桿菌O157:H7檢測中的應(yīng)用[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 38(3):196-199.

Expression of Enhanced Green Fluorescent Protein in DH5αE. coli

WANG Xiao-hui
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Q819

A

1002-6630(2010)21-0200-04

2010-04-19

國家自然科學(xué)基金項目(30972037；30871741)

王曉輝(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wangxh2011@163.com