響應(yīng)面法優(yōu)化勻漿提取刺五加主要酚苷及苷元的工藝

劉 洋，楊 磊，郝婧瑋，祖元剛

（東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

研究開發(fā)

響應(yīng)面法優(yōu)化勻漿提取刺五加主要酚苷及苷元的工藝

劉 洋，楊 磊，郝婧瑋，祖元剛

（東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用響應(yīng)面法對勻漿提取刺五加根莖原料中紫丁香苷、刺五加苷E和異秦皮啶等主要酚苷及苷元成分進行了優(yōu)化?？疾炝藙驖{提取時間、乙醇體積分數(shù)、勻漿轉(zhuǎn)數(shù)和液料比等因素對提取工藝的影響，應(yīng)用了Box-Behnken的實驗設(shè)計，選取了3種目標產(chǎn)物的得率與純度作為響應(yīng)值。響應(yīng)面法優(yōu)化后提取工藝條件為提取時間4.04 min、乙醇體積分數(shù)59.66%、勻漿轉(zhuǎn)數(shù)11 999.6 r/min、液料比7.96∶1 mL/g、提取次數(shù)3次。在所確定的工藝條件下，刺五加紫丁香苷得率0.0016%，純度0.052%；異秦皮啶得率0.018%，純度0.68%；刺五加苷E得率0.035%，純度1.10%。

紫丁香苷；刺五加苷E；異秦皮啶；勻漿提取

在我國，刺五加 [Acanthopanax senticosus（Rupr. et Maxim.）Harms. Syn.Eleutherococccus Senticosus（Rupr. et Maxim.）Maxim]主要分布在東北及河北等地。刺五加活性成分的提取研究主要是采用水提[1]，甲醇[2]、乙醇回流提取[3－5]和超臨界CO2萃取法[6]等。水提、乙醇回流提取，活性成分得率低；超臨界CO2萃取選擇性強，有效成分得率高[6]，但受處理量的限制，產(chǎn)量低，目前工業(yè)開發(fā)難度較大。現(xiàn)代藥理學研究表明，刺五加的主要功效成分為酚苷及其某些苷元類成分，主要包括紫丁香苷、刺五加苷E和異秦皮啶 [分別見圖1(a)、(b)、(c)]等。紫丁香苷具有抗疲勞[7]、增強免疫力[8]、護肝[9]和釋放乙酰膽堿，增加胰島素分泌[10]等作用；刺五加苷E具有緩解壓力、抗焦慮[11]、抗應(yīng)激、抗?jié)兒涂蛊赱12]等作用；異秦皮啶是刺五加苷B1的苷元，具有明顯的抗炎[13]和抗菌[14]作用。2005年版《中國藥典》僅規(guī)定以紫丁香苷為定量指標，以異秦皮啶為定性指標，而刺五加苷E則為某些廠家提取物產(chǎn)品出口的指標。但僅以單一成分為衡量指標難以保證刺五加的全部功效成分得到充分的提取分離和利用。因此，尋找更加有效的提取刺五加功效成分的方法具有現(xiàn)實意義。

勻漿提取法是近年來發(fā)展起來的新型提取技術(shù)，勻漿提取是指生物組織通過加入溶劑進行組織勻漿或磨漿，以提取活體組織中有效成分的一種提取方法。該方法一般應(yīng)用于從動物組織中提取氨基酸、蛋白質(zhì)等目的成分[15－17]，近年來祖元剛等將植物組織應(yīng)用勻漿提取法對萜烯醇、黃酮類物質(zhì)進行提取，收到了很好的效果[18－19]。應(yīng)用勻漿法提取植物活性成分，可以直接將物料置于勻漿機內(nèi)，與提取溶劑在勻漿裝置中混合勻漿，通過機械及液力剪切作用將物料撕裂和粉碎，使物料破碎和有效成分的提取同步進行，達到對植物有效成分快速、強化提取的目的。勻漿提取法提取速度快，溫度低，能耗低，目的成分得率高。本研究利用勻漿法以紫丁香苷、刺五加苷E和異秦皮啶為指標成分，同時以各指標成分的得率和純度為響應(yīng)因子對刺五加中主要成分進行了提取，在單因素實驗的基礎(chǔ)上對勻漿提取過程中的各因素采用響應(yīng)面法（response surface analysis methodology，RSA）進行了優(yōu)化，取得滿意結(jié)果，為規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的工藝參數(shù)。

圖1 刺五加主要成分的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

JJ-2B型組織搗碎勻漿機，購自金壇市榮華儀器制造有限公司；BS-124S電子天平，購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3K30型離心機，美國SIGMA公司產(chǎn)品；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，購自上海亞榮生化儀器廠；717型自動進樣高效液相色譜儀，包括1525二元泵和2487型紫外光檢測器，美國WATERS公司產(chǎn)品。

1.2 實驗材料和試劑

刺五加藥材購于黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場，經(jīng)東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室聶紹荃教授鑒定為刺五加的干燥根莖，用前粉碎成小塊狀。紫丁香苷（111574-200201）、刺五加苷E（11173-200501）和異秦皮啶（110837-200304）對照品購自中國藥品生物制品檢定所；含量測定用乙腈、甲醇為色譜純，購自J&K CHEMICAL LTD.公司；色譜分析用二次蒸餾水自制，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 試驗方法

2.1 分析方法

2.1.1 高效液相色譜定量測定條件

采用高效液相色譜法：色譜柱為Kromasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸（15∶85，體積比）；流速mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長205 nm。

2.1.2 標準曲線的繪制

分別精密稱取紫丁香苷對照品9.84 mg，刺五加苷E對照品10.12 mg，異秦皮啶對照品10.16 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為刺五加對照品儲備液。分別精密量取2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.025 mL和0.01 mL對照品儲備液，用甲醇分別定容至2 mL，分別標為1～7號對照品溶液。均進樣10 μL，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線的方程如表1。

2.1.3 樣品中紫丁香苷、刺五加苷E和異秦皮啶的含量測定

提取液稀釋至適宜的檢測濃度后離心（離心條件：溫度25 ℃；速度12 000 r/min；時間5 min），取上清液進行HPLC檢測，每樣重復進樣3次，將峰面積取平均值，代入回歸方程，依式（1）計算各目的成分的得率，依式（2）計算各目的成分的純度。

表1 標準曲線方程

式中，Y為得率，%；P為純度，%；c為目的成分的濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；M為原料質(zhì)量，g；m為浸膏質(zhì)量，g。

2.2 影響提取工藝效果的因素試驗

2.2.1 單因素試驗

（1）勻漿提取時間

稱取15.0 g/份粉碎后的刺五加根莖原料，15份，分為5組，每組3份，液料比為10∶1，在15份中分別加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，選擇不同的勻漿時間（1 min、2 min、3 min、4和5 min），用勻漿機以10 000 r/min轉(zhuǎn)數(shù)進行勻漿，濾液取1 mL用于含量測定，其余減壓回收溶劑并于60 ℃減壓干燥，計量浸膏重量，計算得率和純度。

（2）乙醇體積分數(shù)

稱取15.0 g/份粉碎后的刺五加根莖原料，27份，分為9組，每組3份，液料比為10∶1，在27份中分別加入體積分數(shù)分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，10 000 r/min勻漿提取4 min，其余操作同（1）。

（3）勻漿轉(zhuǎn)數(shù)

稱取15.0 g/份粉碎后的刺五加根莖原料，15份，分為5組，每組3份，液料比為10∶1，加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，分別以8000 r/min、9000 r/min、10 000 r/min、11 000 r/min和12 000 r/min提取4 min，其余操作同（1）。

（4）液料比

稱取15.0 g/份粉碎后的刺五加根莖原料24份，分為8組，每組3份，分別按不同的液料比（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1和12∶1， mL/g）加入體積分數(shù)60%乙醇以10 000 r/min勻漿提取4 min，其余操作同（1）。

（5）提取次數(shù)

分別稱取15.0 g/份粉碎后的刺五加根莖原料，按液料比10∶1 mL/g加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，以10 000 r/min轉(zhuǎn)數(shù)提取4 min，將每次提取液過濾，濾餅再加入相同溶劑重復上述提取過程1～4次，每次濾液取1 mL用于含量測定，其余濾液合并后減壓回收溶劑并于60 ℃減壓干燥，其余操作同（1）。

2.2.2 工藝優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，由于提取次數(shù)對目標產(chǎn)物的影響已很明確，即提取次數(shù)越多，得率越大，因此提取次數(shù)不作為響應(yīng)面法設(shè)計的主要因素。刺五加勻漿提取過程的主要影響因素包括：乙醇體積分數(shù)、提取時間、勻漿轉(zhuǎn)數(shù)和液料比。以上述主要影響因素作為考察對象，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計分析軟件的響應(yīng)面分析法分別以3種目標產(chǎn)物得率與純度為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析實驗，以獲取最適工藝參數(shù)。試驗因素和水平安排見表2。

表2 響應(yīng)面法分析的因子和水平

對紫丁香苷、刺五加苷E和異秦皮啶的得率和純度的勻漿提取條件進行綜合優(yōu)化，得出結(jié)論。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素對提取效果的影響

3.1.1 勻漿時間

由圖2可以看出，隨著勻漿時間的增加，得率呈遞增趨勢但在4 min后變化趨勢并不明顯，而純度呈遞減趨勢。史權(quán)[15]在研究提到勻漿萃取工藝過程中指出勻漿作用是在最短的時間內(nèi)將藥材與溶劑充分溶合，使溶劑進入藥材，將有效成分從固相轉(zhuǎn)移到液相，使物料中的有效成分與溶劑中的濃度趨于平衡。因而，在此可認為在勻漿時間4 min時溶液中各有效成分已經(jīng)趨于平衡狀態(tài)，提取4 min后得率無明顯變化。進一步延長勻漿時間，某些本不易溶出的雜質(zhì)成分也被溶劑溶出，故隨提取時間增加其純度存在遞減趨勢。因此選擇勻漿時間3～5 min為待進一步優(yōu)化范圍。

圖2 勻漿時間的影響

3.1.2 乙醇體積分數(shù)

由圖3可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)（φ乙醇）的增加，異秦皮啶在φ乙醇＞60%后得率明顯下降，而紫丁香苷與刺五加苷E的得率在φ乙醇＞20%后就呈現(xiàn)下降趨勢。目標產(chǎn)物純度均在φ乙醇＞60%后呈現(xiàn)下降趨勢。說明較高的乙醇體積分數(shù)使更多的雜質(zhì)也同時被提取出來，是導致相應(yīng)純度的下降的原因。相對而言，異秦皮啶的藥理作用最強[6]，3種成分在同時提取過程中的行為相異時，以異秦皮啶為主，以保證提取物具更全面的藥效。因此選擇φ乙醇50%～70%為進一步考察優(yōu)化范圍。

3.1.3 勻漿轉(zhuǎn)數(shù)

由圖4可以看出，隨著勻漿轉(zhuǎn)數(shù)的增加， 紫丁香苷與刺五加苷E得率、純度呈遞增趨勢；但其中異秦皮啶在大于10 000 r/min后得率、純度明顯下降。由于芳香基有較強的吸電子能力，而氧離子是帶負電的，由于苯環(huán)上的吸電子作用，使異秦皮啶中氧原子的電子向芳香基移動，芳基氧上的電子云密度減小，吸引力減弱，導致異秦皮啶的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。因此當勻漿轉(zhuǎn)數(shù)超過10 000 r/min時，由于勻漿機鉸刀的快速剪切作用產(chǎn)生熱效應(yīng)使異秦皮啶的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而表現(xiàn)出隨勻漿轉(zhuǎn)數(shù)增加，異秦皮啶的得率與純度下降的狀況。因此選取勻漿轉(zhuǎn)數(shù)在9000～11 000 r/min之間進行優(yōu)化設(shè)計。

圖3 乙醇體積分數(shù)的影響

圖4 勻漿轉(zhuǎn)數(shù)的影響

3.1.4 勻漿次數(shù)

由圖5可以看出，隨著次數(shù)的增加，得率呈略微遞增趨勢。作者將4次提取的回收率設(shè)定為100%，各成分前3次的回收率均可達到90%以上。而純度無明顯變化。本著節(jié)約成本的原則，選擇勻漿提取3次作為提取刺五加目的物質(zhì)的條件。

圖5 提取次數(shù)的影響

3.1.5 液料比

由圖6可以看出，液料比為8∶1 mL時，3種目標產(chǎn)物得率與純度達到最大值。祖元剛等[18]采用勻漿法研究煙葉中茄尼醇提取時發(fā)現(xiàn)當液料比過小時，其所能溶解的有效成分有限，但溶劑過多時物料與勻漿刀接觸的概率減少，不能充分破碎物料，從而細胞內(nèi)的有效成分不能充分溶出。因此，為了進一步明確液料比對刺五加有效成分提取的影響，選取液料比在(7∶1)～(9∶1) mL/g之間進行優(yōu)化設(shè)計。

3.2 刺五加功效成分勻漿提取條件優(yōu)化

RSA 試驗設(shè)計組合和3種目標產(chǎn)物的得率與純度見表2，RSA 試驗設(shè)計組合和茄尼醇皂化的響應(yīng)面試驗中，29個試驗點可以分為兩類：其一是析因點，自變量取值在A、B、C、D 所構(gòu)成的三維頂點，共有24 個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。RSA 試驗設(shè)計與試驗結(jié)果見表3。

圖6 液料比的影響

以3種目標產(chǎn)物的得率與純度為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計中ANOVA分析，各實驗?zāi)Ｐ途@著，同時，失擬情況均為不顯著，這表明試驗所模擬的模型可用。

在模型中，當p值小于0.05時表明該模型項為顯著因素。因此，通過表4可知，對異秦皮啶得率影響顯著的因素有：一次項C和二次項A2、B2和D2；對異秦皮啶純度影響顯著的因素有：一次項C和二次項A2、B2和 D2；對紫丁香苷得率影響顯著的因素有：一次項C和二次項A2、B2和 D2；對紫丁香苷純度影響顯著的因素有：一次項D和二次項AD、A2、B2和 D2；對刺五加苷E得率影響顯著的因素有：二次項A2、B2和 D2；對刺五加苷E純度影響顯著的因素有：二次項A2、B2和 D2。其中乙醇體積分數(shù)和液料比的交互作用對紫丁香苷純度影響顯著，見圖7。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計方案及實驗結(jié)果

表4 各響應(yīng)值的回歸分析結(jié)果的p值

圖7 乙醇體積分數(shù)和液料比對紫丁香苷純度影響的響應(yīng)面和等高線

應(yīng)用Design Expert 7.0中Box-Behnken中Optimization Choises的Numerical Optimization對3種目標產(chǎn)物的得率與純度進行最優(yōu)化（maximize）設(shè)計。得到在同一提取條件下，3種目標產(chǎn)物的得率及純度最佳的提取工藝條件：液料比7.96∶1 mL/g，乙醇體積分數(shù)59.66%，勻漿時間4.04 min，勻漿轉(zhuǎn)數(shù)11 999.6 r/min，提取次數(shù)3次。3種目標產(chǎn)物的得率及純度分別為：異秦皮啶得率0.018%、異秦皮啶純度0.69%、紫丁香苷得率0.001 86%、紫丁香苷純度0.0578%、刺五加苷E得率0.036%和刺五加苷E純度1.14%，其合意性（desirability）為0.864。而3種目標產(chǎn)物的得率及純度的綜合影響的合意性，可見圖8。

3.3 最佳條件的驗證實驗

取15.0 g粉碎的刺五加根莖原料（絕干計）裝入勻漿機中，在最佳勻漿條件下提取，重復實驗3次取平均值，驗證實驗結(jié)果。紫丁香苷得率為0.0016%，純度0.052%，與理論值分別相差0.000 3%（絕對值，下同）和0.004%；刺五加苷E得率為0.035%，純度1.10%，與理論值分別相差0.001%和0.04%；異秦皮啶得率為0.018%，純度0.68%，與理論值分別相差0.000%和0.01%。

圖8 各因素對目標產(chǎn)物的得率與純度的合意性的響應(yīng)面和等高線

4 結(jié) 論

采用勻漿法以異秦皮啶、紫丁香苷和刺五加苷E為指標成分，同時以各指標成分的總得率和純度為響應(yīng)因子對刺五加中的主要功效成分進行了提取，在單因素實驗的基礎(chǔ)上對勻漿提取過程中的各因素采用響應(yīng)面法進行了優(yōu)化，得到刺五加的最佳勻漿提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)59.66%、液料比7.96∶1 mL/g 、提取時間4.04 min、勻漿轉(zhuǎn)數(shù)11 999.6 r/min、提取次數(shù)3次。最佳條件下的驗證實驗表明：刺五加紫丁香苷得率可達0.0019%，純度0.058%；異秦皮啶得率可達0.018%，純度0.69%；刺五加苷E得率可達0.036%，純度1.14%。

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Optimization of homogenized extraction of phenol glycosides and aglycones from the root of acanthopanax senticosus harms using response surface analysis

LIU Yang，YANG Lei，HAO Jingwei，ZU Yuangang
（Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Northeast Forestry University，Ministry of Education，Harbin 150040，Heilongjiang，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the process of homogenized extraction of five main phenol glycosides and aglycones（target products）from the root of Acanthopanax senticosus（Rupr. Et Maxim.）Harms. According to Box-Behnken experiment design，four independent variables were selected，i.e. ethanol volume fraction，extracting time，homogenization power and liquid to solid ratio，to investigate the influence on extraction efficiency. Meanwhile，extraction rate and the purity of three target products were chosen as responses. The optimal parameters were obtained as：extraction time of 4.04min，ethanol volume fraction of 59.66%，homogenization velocity of 11 999.6 r/min，liquid to solid ratio of 7.96∶1 mL/g and 3 times. Under the optimized condition，the extraction rate and purity of three target products were found as 0.001 6% and 0.052% for syringin，0.018% and 0.68% for isofraxidin，0.035% and 1.10% for eleutheroside E，respectively.

syringin；eleutheroside E；isofraxidin；homogenized extraction

TQ 460.6

A

1000–6613（2010）04–0745–08

2009-10-23；修改稿日期：2009-12-27。

國家科技支撐計劃項目（2006BAD18B04）。

劉洋（1984—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：祖元剛，教授，博士，博士生導師，從事植物化學和植物藥研發(fā)。E-mail zygorl@126.com。