微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)及其在石油污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

吳作軍，盧滇楠，張敏蓮，劉 錚

（清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

特約評(píng)述

微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)及其在石油污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

吳作軍，盧滇楠，張敏蓮，劉 錚

（清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

概述了微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的原理及在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。該技術(shù)可以提供土壤微生物群落多樣性信息，跟蹤降解菌株（群）的定植及發(fā)揮作用的過(guò)程，展現(xiàn)投加菌株與土著菌群相互作用的信息，為生物修復(fù)中降解菌的篩選、修復(fù)過(guò)程的強(qiáng)化及修復(fù)結(jié)果的評(píng)估提供生物學(xué)信息。展望了該技術(shù)在土壤生物修復(fù)中應(yīng)用的前景。

土壤生物修復(fù)；分子生態(tài)學(xué)；微生物分子生態(tài)學(xué)；分子生物學(xué)

分子生態(tài)學(xué)這一概念首先見(jiàn)諸于《Molecular Ecology》發(fā)刊詞[1]，它是以分子生物學(xué)技術(shù)為工具來(lái)研究特定環(huán)境中的微生物區(qū)系組成、結(jié)構(gòu)、功能、適應(yīng)性發(fā)展及其分子機(jī)制等，從遺傳、種類(lèi)和生態(tài)系統(tǒng)層次上揭示微生物群落演變的規(guī)律，反映生態(tài)環(huán)境和外界脅迫對(duì)微生物群落的影響[2－4]。20世紀(jì)70年代以前，微生物多樣性的研究主要采用分離培養(yǎng)方法，依據(jù)形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特征、生理生化特性進(jìn)行分類(lèi)。此類(lèi)方法無(wú)法反映出占土壤微生物中絕大多數(shù)的未培養(yǎng)微生物的信息，所得到的環(huán)境微生物群落多樣性是不全面的。20世紀(jì)70～80年代生物標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，提高了對(duì)于環(huán)境微生物群落多樣性的分析精度。80～90年代，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的引入，可直接給出環(huán)境中微生物的遺傳信息，提供土著微生物組成和結(jié)構(gòu)依據(jù)。

正如Vogel和Walter[5]所指出的那樣：“微生物生態(tài)學(xué)問(wèn)題是生物修復(fù)技術(shù)中最重要的部分?！苯馕鎏囟ōh(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)可直接展示環(huán)境體系生態(tài)功能特性、修復(fù)過(guò)程中微生物群落演變以及投加菌株的定植情況，為生物修復(fù)過(guò)程中優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)、篩選高效降解菌株、協(xié)調(diào)微生物群落功能和確定工程實(shí)施方案提供依據(jù)，并可用于評(píng)估生物修復(fù)的效果。微生物分子生態(tài)學(xué)為土壤生物修復(fù)的基礎(chǔ)創(chuàng)新和工程應(yīng)用提供了有力的基礎(chǔ)科學(xué)工具。

1 土壤生物修復(fù)技術(shù)研究現(xiàn)狀

土壤生物修復(fù)是利用微生物及其它生物去除存在于土壤和地下水體中的有毒有害污染物，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化成無(wú)害化物質(zhì)的技術(shù)和方法。根據(jù)微生物來(lái)源及施加方式劃分，主要分為自然衰減技術(shù)（natural attenuation），生物強(qiáng)化技術(shù)（bioaugmentation）和生物刺激技術(shù)（biostimulation）。生物修復(fù)技術(shù)是修復(fù)石油污染耕地的有效措施，被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局（USEPA）推薦作為原油污染土壤修復(fù)的首選措施。表1總結(jié)了上述生物修復(fù)技術(shù)的主要特征。

表1 生物修復(fù)技術(shù)的分類(lèi)以及主要特點(diǎn)

我國(guó)目前對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)研究主要集中于高效降解菌株（群）的篩選及特性研究和生物修復(fù)實(shí)施方法的改進(jìn)兩個(gè)方面[6－7]。中科院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所孫鐵珩等[8－18]篩選了多株具有高降解活性的微生物，在真菌對(duì)石油化合物的降解行為進(jìn)行了深入研究。南開(kāi)大學(xué)周啟星等[19－20]對(duì)石油污染土壤的植物修復(fù)、微生物-植物復(fù)合修復(fù)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究工作，采用蚯蚓對(duì)已修復(fù)的土壤的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)。南京土壤研究所的駱永明等[21－23]利用微生物培養(yǎng)、碳素利用法（Biolog）和發(fā)光細(xì)菌生物毒性測(cè)定對(duì)污染土壤的微生物數(shù)量和多樣性進(jìn)行分析。清華大學(xué)劉錚等提出了土壤環(huán)流誘導(dǎo)馴化篩選方法并得到了多株石油烴降解菌；研制出固態(tài)大孔微生物制劑[24]，采用低溫等離子體誘變技術(shù)得到耐鹽陰溝腸桿菌[25]；提出并實(shí)現(xiàn)了真菌-細(xì)菌協(xié)同原位降解石油烴技術(shù)[26－27]及其與耕作層麥秸填埋發(fā)酵相結(jié)合的油-鹽混合污染耕地原位修復(fù)技術(shù)[28－30]，將分子生態(tài)學(xué)技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)控和強(qiáng)化生物修復(fù)過(guò)程。該研究團(tuán)隊(duì)2006年在中原油田（河南濮陽(yáng)）完成了面積為11畝的石油污染耕地的現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)，修復(fù)地塊小麥產(chǎn)量達(dá)到正常耕地的70%，品質(zhì)符合國(guó)家規(guī)定，授權(quán)和公開(kāi)專(zhuān)利7項(xiàng)[31－37]。

2 分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在土壤修復(fù)中的應(yīng)用

2.1 微生物分子生態(tài)學(xué)分析技術(shù)概述

現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)主要分為基于PCR擴(kuò)增和不基于PCR擴(kuò)增的分析技術(shù)?；赑CR擴(kuò)增的技術(shù)根據(jù)分析目標(biāo)種群DNA片段的不同又可以分為以一段特定種群DNA片段為研究對(duì)象的種群DNA片段分析技術(shù)（partial community DNA analysis）和以全部種群DNA為研究對(duì)象的全種群DNA分析技術(shù)（whole community DNA analysis）[38]。其中種群DNA片段分析技術(shù)又包括PCR片段克隆測(cè)序技術(shù)和基因圖譜技術(shù)，PCR片段克隆測(cè)序技術(shù)主要用于分析不同地理位置，耕作模式和理化性質(zhì)土壤之間的微生物種群多樣性[39]。此方法操作復(fù)雜、耗時(shí)且克隆選擇數(shù)目對(duì)微生物多樣性分析的全面性有較大影響?；驁D譜技術(shù)是目前微生物分子生態(tài)學(xué)分析廣泛采用的一類(lèi)分析技術(shù)，包括變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE/TGGE）[40]、擴(kuò)增核糖體DNA片段限制性分析（ARDRA）[41]、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多樣性分析（T-RFLP）[42]、核糖體基因間序列分析（RISA）[43]和隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多樣性（RAPD）[44]。與PCR片段克隆測(cè)序技術(shù)相比，基因圖譜技術(shù)更適宜于微生物組成更為復(fù)雜的環(huán)境樣品，且操作更為便捷?；赑CR擴(kuò)增的分析方法由于其中包括了對(duì)目的樣品的DNA片段的PCR擴(kuò)增過(guò)程，所以PCR的擴(kuò)增效率是這類(lèi)技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素。表2中列出了目前常用的基于PCR的微生物分子生態(tài)學(xué)分析技術(shù)。

在不依賴(lài)于PCR的微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法中，應(yīng)用最為廣泛的是熒光原位雜交（FISH）分析技術(shù)，此外還有熒光染色計(jì)數(shù)技術(shù)、微生物理化性質(zhì)檢測(cè)鑒定技術(shù)、磷脂脂肪酸分析技術(shù)等。這類(lèi)技術(shù)主要依靠微生物本身細(xì)胞組成和生長(zhǎng)特性的不同進(jìn)行分析，與基于PCR的分子生態(tài)學(xué)分析技術(shù)相比，存在一定的不足，例如不能提供詳細(xì)的微生物群落信息或特定菌株（群）的生長(zhǎng)信息等，但二者可結(jié)合使用，得到更全面和準(zhǔn)確的微生物群落結(jié)構(gòu)信息。

表2 常用的微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)一覽表

2.2 微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在土壤修復(fù)過(guò)程中的應(yīng)用

2.2.1 變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE/TGGE）DGGE/TGGE最早是一種應(yīng)用于檢測(cè)DNA的點(diǎn)突變的電泳技術(shù)[45]，根據(jù)變性梯度和電場(chǎng)方向不同，分為垂直梯度電泳和平行梯度電泳。垂直梯度電泳中變性劑/溫度梯度方向與電場(chǎng)方向相垂直，可以具有較大的梯度應(yīng)用范圍，較多地應(yīng)用于DNA突變的篩選；平行梯度電泳中變性劑/溫度梯度方向與電場(chǎng)方向相平行，變性劑/溫度梯度范圍相對(duì)較窄，但是具有更高的分離精度，可以較好地滿(mǎn)足微生物多樣性分析的要求。自1993年Muyzer等[40]首次將DGGE應(yīng)用于土壤微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于土壤、根系、沙丘、高溫?zé)崛⒑?、長(zhǎng)江、海洋、水體、發(fā)酵食品等環(huán)境微生物群體多樣性的研究和微生物群體動(dòng)態(tài)的追蹤研究上。

Wilfred等[46]將DGGE用于石油污染土壤的原位修復(fù)過(guò)程研究中，在為期1年的場(chǎng)地試驗(yàn)中采用該技術(shù)跟蹤土壤菌群變化，發(fā)現(xiàn)雖然石油烴降解效率隨著時(shí)間的增加而增加，但是菌落結(jié)構(gòu)在不同時(shí)間和不同處理中并沒(méi)有較明顯的變化。Marc Vinas等[47]將PCR-DGGE和主成分分析相結(jié)合對(duì)雜酚油污染土壤的實(shí)驗(yàn)室修復(fù)過(guò)程中細(xì)菌群落變化的動(dòng)力學(xué)以及對(duì)多環(huán)芳烴的降解特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在修復(fù)早期α-Proteobacteria綱在所有處理中都占有優(yōu)勢(shì)，后期γ-Proteobacteria綱、α-Proteobacteria綱和Cytopage-Flexibacter-Bacteroides綱在未添加營(yíng)養(yǎng)的處理中占優(yōu)勢(shì)，而γ-Proteobacteria綱、β-Proteobacteria綱和α-Proteobacteria綱在添加營(yíng)養(yǎng)的處理中占優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明特定的細(xì)菌類(lèi)型既與不同的生物修復(fù)階段有關(guān)，也與污染土壤中營(yíng)養(yǎng)的添加與否有關(guān)。Li等[48]研究了石油污染土壤中的細(xì)菌多樣性和土壤酶活性變化。實(shí)驗(yàn)樣品的石油烴含量從277.11 mg/(kg土)到5213.37 mg/(kg土)，結(jié)果表明，隨著石油烴濃度增加，細(xì)菌多樣性和土壤脫氫酶活也有一定的增加。Michael等[49]從多環(huán)芳烴（PAH）污染土壤中分離得到一株可以降解PAH的鞘脂菌屬（Sphingobium sp.）細(xì)菌B1，DGGE發(fā)現(xiàn)投加菌株明顯影響土著菌群的組成，并且在土著菌群中具有降解特性的菌群占據(jù)數(shù)量的多數(shù)。Nuria等[50]在治理西班牙北海岸石油污染沙灘時(shí)，采用DGGE分析表明細(xì)菌群落主要為α-Proteobacteria綱、γ-Proteobacteria綱和Bacteroides綱也同時(shí)存在，但是數(shù)量相對(duì)較少。Li等[51]在110 天的試驗(yàn)室模擬試驗(yàn)中，采用DGGE對(duì)煤油污染土壤的生物修復(fù)過(guò)程中的群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并將DGGE技術(shù)與微生物培養(yǎng)技術(shù)、土壤微生物酶活測(cè)定等技術(shù)相結(jié)合。結(jié)果表明，在煤油污染土壤的生物修復(fù)中α亞種中的Sphingomonadaceae菌科變化較大，可以作為煤油污染土壤修復(fù)中的指示劑。Coppotelli等[52]采用DGGE技術(shù)研究了由菲污染土壤中分離得到的菌株Sphingomonas paucimobilis 20006FA對(duì)菲污染土壤中菌群變化的影響。結(jié)果表明，該菌株可以較好降解土壤中的菲，并且促進(jìn)土壤土著微生物的生長(zhǎng)，特別是菲利用菌株的生長(zhǎng)。

將DGGE與TGGE結(jié)合可以給出特定環(huán)境體系的微生物組成結(jié)構(gòu)信息，有助于分離和馴化高效的污染物降解菌株。Smalla等[53]利用DGGE/TGGE分析了馬鈴薯根系土壤的微生物組成，通過(guò)特定的營(yíng)養(yǎng)條件馴化出兩種不同的菌群，這兩種菌群對(duì)植物根系的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)換起到了關(guān)鍵作用，顯示出DGGE/TGGE指導(dǎo)菌株分離的可能性。Wawer等[54]利用DGGE技術(shù)對(duì)硫酸鹽還原菌群Desulfovibrio中的脫氫酶基因的多樣性進(jìn)行分析，說(shuō)明了不同的Desulfovibrio菌種在環(huán)境中的組成和分布情況。隨著功能基因序列信息越來(lái)越完整，采用PCR-DGGE/TGGE的方法通過(guò)對(duì)功能基因的多樣性分析也是了解特定環(huán)境體系中功能微生物群落結(jié)構(gòu)的一種方法。

2.2.2 末端限制性長(zhǎng)度多樣性技術(shù)（T-RFLP）

限制性?xún)?nèi)切酶和熒光標(biāo)記引物PCR技術(shù)的發(fā)展為T(mén)-RFLP奠定了基礎(chǔ)。Cancilla等[55]首次采用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因外重復(fù)回文序列，對(duì)Lactococcus lactis 菌株的基因圖譜進(jìn)行分析，形成了熒光加強(qiáng)的重復(fù)回文序列PCR技術(shù)（FERP）。Avaniss-Aghajani等[56]首次利用了熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增了16S rDNA序列，形成了快速準(zhǔn)確的廣譜細(xì)菌群落分析技術(shù)。T-RFLP技術(shù)融上述兩種技術(shù)于一體，其原理是根據(jù)微生物16S rDNA兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5’端用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，常用的熒光物質(zhì)有HEX、6-FAM等。所得到的5’端熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，根據(jù)限制性酶切位點(diǎn)的差異，酶切后獲得長(zhǎng)短不一的限制性片段，這些末端帶有熒光標(biāo)記的限制性片段用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。由于不同長(zhǎng)度的末端限制性片段代表不同的微生物，而且相同長(zhǎng)度的末端限制性片段代表至少一種微生物的存在，所以這些末端標(biāo)記的片段可以用來(lái)反映微生物菌落的組成情況[57－60]。

Liu等[57]最早將T-RFLP技術(shù)應(yīng)用于土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)的分析。Katsivela等[61]利用T-RFLP技術(shù)對(duì)石油污染土壤原位修復(fù)的微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化情況進(jìn)行了分析，在14個(gè)月的修復(fù)過(guò)程中，土壤中正構(gòu)烷烴降解率可以達(dá)到75%～100%，石油降解菌群數(shù)量居土著微生物中主導(dǎo)地位，與不添加石油降解菌株的處理相比，石油烴的降解效率顯著提高。Denaro等[62]利用T-RFLP技術(shù)檢測(cè)了3個(gè)石油烴污染水體的細(xì)菌群落分布，分析了3個(gè)月內(nèi)的細(xì)菌群落多樣性的變化情況，結(jié)果表明限制性末端數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的菌群是石油烴降解菌群，在生物修復(fù)不同階段中，細(xì)菌菌群變化較明顯。

T-RFLP技術(shù)具有比電泳為基礎(chǔ)的群落分析方法（ARDRA）更好的靈敏度和準(zhǔn)確性，但由于T-RFLP難以像DGGE/TGGE技術(shù)那樣提供詳細(xì)的序列信息，所以在微生物組成分析方面存在缺陷。但T-RFLP技術(shù)因其熒光標(biāo)記的靈敏性，是監(jiān)控環(huán)境體系中特定微生物如污染物降解菌群的生長(zhǎng)的高效工具。

2.2.3 其它方法

微生物多樣性的分析檢測(cè)方法仍然在發(fā)展中，目前出現(xiàn)的新技術(shù)可歸納為三大類(lèi)。

第一類(lèi)是基于PCR的方法。例如核糖體基因間序列分析（RISA）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多樣性（RAPD）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。RISA原理在于選擇了微生物rrs和rrl基因之間的一段間隔序列（IGS）作為分析對(duì)象，得到關(guān)于這段序列的相關(guān)信息，對(duì)多樣性進(jìn)行分析，但是由于該段序列的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如16S rDNA序列信息豐富，所以對(duì)該技術(shù)的廣泛應(yīng)用有所抑制。RAPD主要是利用合成的10 bp小引物進(jìn)行隨機(jī)結(jié)合擴(kuò)增，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳檢測(cè)具有不同的條帶信息，但是這種技術(shù)的重復(fù)性相對(duì)較差，并且這種技術(shù)不能提供詳細(xì)的種群信息，對(duì)于微生物組成的分析顯然是不夠的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR保留了PCR技術(shù)的敏感性和特異性，可以通過(guò)光電傳導(dǎo)系統(tǒng)實(shí)時(shí)原位和定量檢測(cè)PCR擴(kuò)增，匯集了DNA雜交的高特異性和光譜的高靈敏性[63]。

第二類(lèi)是不依賴(lài)PCR的技術(shù)。例如熒光染色計(jì)數(shù)技術(shù)[64]可以快速、簡(jiǎn)便計(jì)量活菌和死菌的數(shù)量，采用不同染料即可在熒光檢測(cè)器下進(jìn)行活菌或死菌計(jì)數(shù)。熒光原位雜交技術(shù)可以直接鑒定以及定量分析樣品中的特定的微生物或者是分類(lèi)群[65]。該方法中被研究的微生物細(xì)胞被固定，其原理是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與環(huán)境樣品內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過(guò)熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號(hào)，來(lái)確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布[66－67]，或者結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其它細(xì)胞器中的定位。

第三類(lèi)是基于生物細(xì)胞內(nèi)特征物質(zhì)來(lái)分析微生物多樣性，利用這些特征性物質(zhì)可以在屬甚至種的水平上對(duì)微生物生態(tài)狀況進(jìn)行分析。磷脂脂肪酸譜圖分析、脂肪酸譜圖分析、甲基脂肪酸圖譜分析、生物醌圖譜分析等，這些方法也可用于群落動(dòng)態(tài)分析。

綜上所述，分子生態(tài)技術(shù)作為一種有效的生物監(jiān)控手段，直接反映了微生物菌株定植、菌群的動(dòng)態(tài)變化等，是修復(fù)過(guò)程監(jiān)測(cè)和結(jié)果評(píng)估的科學(xué)工具，也為修復(fù)過(guò)程優(yōu)化的提供了重要依據(jù)。

3 微生物分子生態(tài)學(xué)在土壤生物修復(fù)中應(yīng)用展望

土壤修復(fù)作為環(huán)保產(chǎn)業(yè)的組成部分，其發(fā)展首先受到國(guó)家的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)建設(shè)需求的牽引。據(jù)預(yù)測(cè)，我國(guó)的環(huán)保產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)規(guī)模將從1995年的29億美元擴(kuò)展到2010年的130億美元。在此之前，我國(guó)環(huán)保領(lǐng)域的污染物處理產(chǎn)業(yè)主要集中于污水處理、廢棄物管理和空氣污染治理。伴隨著新一輪經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，工業(yè)化和城鎮(zhèn)化步伐加快，我國(guó)面臨的土地緊張矛盾將更加突出，而全社會(huì)科學(xué)水平和環(huán)境意識(shí)的提高，將促使人們更加注重并追求生產(chǎn)和生活環(huán)境的安全，更加關(guān)注地下水體、耕地、廠(chǎng)區(qū)、居民區(qū)的土地安全問(wèn)題。這些都為土壤修復(fù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了巨大的需求牽引力。

與之對(duì)應(yīng)，污染土壤的修復(fù)得到了我國(guó)政府和學(xué)術(shù)界的高度重視，“十一五”期間科技部啟動(dòng)了土壤生物修復(fù)的系列重點(diǎn)項(xiàng)目。中國(guó)科學(xué)院完成的“中國(guó)2050年生物質(zhì)資源科技發(fā)展路線(xiàn)圖”中也將土壤生物修復(fù)納入到重要的戰(zhàn)略目標(biāo)中，其重要性不言自明——沒(méi)有優(yōu)質(zhì)土壤作為基礎(chǔ)，基于生物質(zhì)的資源和能源的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化只能是夢(mèng)想。

當(dāng)前我國(guó)污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)研究方興未艾，但也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。要推進(jìn)我國(guó)土壤修復(fù)這一關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的事業(yè)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，需要先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)和嚴(yán)格的環(huán)保法規(guī)體系“雙輪驅(qū)動(dòng)”。在科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，當(dāng)前需要解決的問(wèn)題主要是以下幾個(gè)方面。

（1）提高土壤修復(fù)研究的科技水平。土壤組成復(fù)雜、組分間相互作用（物理、化學(xué)、生物）復(fù)雜、修復(fù)過(guò)程呈現(xiàn)開(kāi)放體系特性，這對(duì)于揭示修復(fù)過(guò)程的微觀機(jī)理提出了特殊的挑戰(zhàn)。如果研究工作只是停留在宏觀表象層面，則研究成果的可推廣性會(huì)受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致在修復(fù)技術(shù)研發(fā)方面的“重復(fù)投資”。而要解決上述問(wèn)題，需要引入更為先進(jìn)的概念和工具。本文所介紹的微生物分子生態(tài)學(xué)就有望全面展現(xiàn)參與石油污染物降解的微生物群體的整體全貌及其演變規(guī)律，而這是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法所難以實(shí)現(xiàn)的。

（2）需要建立全面的土壤修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)，推進(jìn)依法理賠、依法復(fù)耕。事實(shí)上，修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容和方法也是科技進(jìn)步的綜合體現(xiàn)。我國(guó)當(dāng)前耕地土壤污染程度或者修復(fù)效果評(píng)估尚完全依據(jù)的是化學(xué)組分分析，而賠償標(biāo)準(zhǔn)則多是基于糧食產(chǎn)量的受損情況。上述方法的待改進(jìn)之處在于：化學(xué)分析方法反映的是單一有毒有害成分的去除情況，而以產(chǎn)量定賠付具有人為干預(yù)性，也影響到了農(nóng)民修復(fù)土地上進(jìn)行復(fù)耕的積極性。從科學(xué)內(nèi)涵上分析：上述指標(biāo)均難以直接衡量或者反映土壤涵養(yǎng)生物和生命過(guò)程的能力——耕地最重要的功能。因此，應(yīng)當(dāng)將微生態(tài)指標(biāo)體系引入到耕地污染和修復(fù)評(píng)估體系中，以反映耕地最重要的本征功能——參與生命活動(dòng)的種群（功能基因）的數(shù)量和組成。

（3）環(huán)保法規(guī)的建設(shè)和實(shí)施。依法推進(jìn)污染土壤的修復(fù)和修復(fù)后耕地的復(fù)耕是保護(hù)國(guó)家土地和耕地資源的基本措施，也是推進(jìn)土壤修復(fù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步的法律動(dòng)力。

土壤微生物在眾多生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，采用微生物分子生態(tài)學(xué)的方法可以從基因?qū)用嫔仙钊虢馕鐾寥篮暧^微生物和功能微生物種群的組成和數(shù)量，用以反映土壤的生物學(xué)特性，為生物修復(fù)的評(píng)估提供重要的、客觀的、全面的指標(biāo)。促進(jìn)分子生態(tài)學(xué)在土壤修復(fù)領(lǐng)域中的應(yīng)用將為加速我國(guó)污染土壤的修復(fù)、保障國(guó)家珍貴的土地資源、實(shí)施生物質(zhì)資源路線(xiàn)、最終實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展等提供科技動(dòng)力。

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Progress in applications of microbiological molecular ecology in bioremediation of petroleum contaminated soil

WU Zuojun，LU Diannan，ZHANG Minlian，LIU Zheng
（Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China）

This review starts with a brief introduction on principles and methods of microbiological molecular ecology as well as their applications in soil remediation. In addition to the genetic information of soil microbial community，the use of microbial molecular ecological tools enables the monitoring of the growth and function of inoculant degrading microbials，as well as their interaction with the indigenous microorganisms. These information are of fundamental importance for the selection and screening of degradation microbial communities，the intensification of degradation process，and the evaluation of remediated soil. Application perspective of microbiological molecular ecology is also discussed.

soil bioremediation；molecular ecology；microbial molecular ecology；molecular biology

TQ 033

A

1000-6613（2010）05-0789-07

2010-01-11；修改稿日期：2010-03-19。

吳作軍（1982—），男，錫伯族，博士研究生。聯(lián)系人：劉錚，教授，博士生導(dǎo)師。電話(huà) 010-62799876；E-mail liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn。