絡(luò)合萃取法分離發(fā)酵液中丙酸

馮小海，陳 飛，姚 忠，章 燕，徐 虹

（1南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2寧波市藥品檢驗所，浙江 寧波 315040）

研究開發(fā)

絡(luò)合萃取法分離發(fā)酵液中丙酸

馮小海1，陳 飛1，姚 忠1，章 燕2，徐 虹1

（1南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2寧波市藥品檢驗所，浙江 寧波 315040）

利用絡(luò)合萃取法對模擬溶液和發(fā)酵液中的丙酸分離進行研究。絡(luò)合劑、稀釋劑篩選結(jié)果表明：選用甲基三辛基氯化胺（MTAC）為絡(luò)合劑、正辛醇為稀釋劑時，萃取受pH值和無機陰離子影響較小，對丙酸具有較高的選擇性。以1.2 mol/L的MTAC為萃取有機相，有機相/水相（體積比）為3的條件下，萃取15 min即能達到平衡；該系統(tǒng)適用于較高濃度丙酸發(fā)酵液萃取，經(jīng)4級萃取丙酸萃取率達86.2%。

丙酸；絡(luò)合萃??；甲基三辛基氯化胺

丙酸是一種重要的三碳平臺化合物，丙酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于谷物保存、橡膠、油漆等領(lǐng)域[1－2]。近年來，生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸由于原料可再生、對環(huán)境溫和而受到了廣泛的關(guān)注[3－4]。丙酸生產(chǎn)效率低和產(chǎn)物分離困難是發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸過程中的面臨的主要問題[5－6]。隨著新型丙酸生產(chǎn)技術(shù)的的開發(fā)，特別是固定化技術(shù)和丙酸成套裝置的應(yīng)用，丙酸生產(chǎn)效率得到了較大提高[6－13]。但是，由于存在乙酸、琥珀酸等副產(chǎn)物[10]，丙酸分離的難度較大，至今未能取得突破性進展，極大地限制了生物基丙酸的工業(yè)化，因此開發(fā)新型生物基丙酸分離工藝迫在眉睫。

丙酸的提取方法主要包括離子交換法和絡(luò)合萃取法[5,14－17]。與離子交換法相比，絡(luò)合萃取法對于包括丙酸在內(nèi)的有機酸分離具有高效性，是近年來較為活躍的研究領(lǐng)域之一[15－19]。不同種類的絡(luò)合劑對有機酸萃取效果差別較大[15]，以往研究者主要采用伯胺、仲胺、叔胺作為絡(luò)合劑進行丙酸萃取[5,15,20]，較少見到利用季銨進行丙酸絡(luò)合萃取的研究。目前國內(nèi)對于丙酸萃取的研究主要集中于丙酸純?nèi)芤狠腿17,20]，未見丙酸發(fā)酵液萃取分離方面的報道。

本研究對用于丙酸分離的絡(luò)合劑、稀釋劑進行了篩選與優(yōu)化，開發(fā)了一種利用季銨鹽萃取分離丙酸純?nèi)芤汉桶l(fā)酵液的新方法，考察了其它有機酸（乙酸、琥珀酸）和無機陰離子對丙酸萃取的競爭效應(yīng)，優(yōu)化了實際發(fā)酵液體系中的丙酸絡(luò)合萃取條件。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.2 萃取平衡實驗

將萃取相（含絡(luò)合劑與稀釋劑）和被萃取溶液各2 mL置于10 mL離心管中，置于恒溫水浴搖床，溫度35 ℃，頻率180 r/min，振蕩2 h。以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，針筒取出下層水樣，采用HPLC法測定水相中有機酸含量[7]，有機相中丙酸及其它有機酸含量通過物料平衡方程計算得到。萃取平衡系數(shù)（Kd）為有機相中有機相溶質(zhì)濃度與水相中溶質(zhì)濃度的比值，萃取率（%）即為有機相中溶質(zhì)質(zhì)量與原液溶質(zhì)質(zhì)量的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 絡(luò)合劑和稀釋劑的篩選

2.1.1 絡(luò)合劑和稀釋劑種類對模擬體系中丙酸分配系數(shù)的影響

選用TOC和MTAC作為絡(luò)合劑，正辛醇（octanol）和煤油（kerosene）作為稀釋劑對丙酸水溶液（20 g/L，自然pH值為2.5）進行萃取情況考察（圖1）。由圖1可知，在自然pH值條件下，不同極性的稀釋劑對TOC萃取丙酸的效果影響很大。極性稀釋劑正辛醇有助于丙酸與TOC形成具有一定極性的離子對萃合物的溶解，從而提高絡(luò)合萃取劑的萃取能力[19]。由于TOC與煤油配合使用時丙酸溶液的Kd最小，不予采用。MTAC與煤油或正辛醇配合使用時Kd接近，但MTAC-煤油萃取丙酸過程中會出現(xiàn)第三相，不利于丙酸萃取，故選用正辛醇作為稀釋劑。

圖1 絡(luò)合劑與稀釋劑篩選

2.1.2 不同pH值丙酸水溶液萃取情況考察

配制pH值分別為2.5、4.0、5.0、6.0、7.0的丙酸水溶液（20 g/L, pH值由6 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)獲得），考察pH值對于絡(luò)合萃取的影響。如圖2所示，隨著pH值的升高，TOC對丙酸的萃取分配系數(shù)顯著降低，當(dāng)pH值為5.0～7.0時，萃取分配系數(shù)Kd接近為零；而MTAC對于丙酸的萃取效果受pH值的影響較小，在pH值為6.0～7.0的情況下，仍能提供1.5左右的分配系數(shù)。丙酸發(fā)酵pH值一般在接近中性的條件下進行，因此TOC萃取有機酸的過程主要以離子對締合和氫鍵締合為主。在較低pH值條件下分子態(tài)丙酸摩爾分數(shù)較高，萃取機理以氫鍵締合為主[式（1）]；隨著pH值的升高，離子態(tài)丙酸摩爾分數(shù)增加，萃取機理轉(zhuǎn)向以離子對締合為主[式（2）]，但是，由于水溶液中的質(zhì)子不斷減少，季銨陽離子的生成量降低，阻礙了離子締合的第二步反應(yīng)，在圖2中表現(xiàn)為TOC-正辛醇對丙酸的萃取分配系數(shù)顯著降低。此外，MTAC是一種季銨鹽，能夠直接與Lewis酸性有機酸的陰離子進行陰離子交換，形成萃合物，完成萃取分離過程。因此，MTAC的pH值擺動效應(yīng)不明顯（圖2），隨著pH值的增大，分配系數(shù)有所下降，原因在于OH－競爭性地參與了R3NH+與丙酸根進行的陰離子交換過程。

國際油價波動具有短周期約2～5年、長周期約8～10年的特點，本輪油價已進入中高位波動區(qū)間。2018年1-11月，布倫特和WTI原油月均價分別突破70美元/桶和65美元/桶，最大漲幅分別超過25%和24%。2017年，布倫特和WTI平均價格分別為64.2美元/桶和57.9美元/桶，比上年分別上漲20%和11%。2017年，國際油價經(jīng)歷了一季度相對穩(wěn)定，二季度震蕩回調(diào)，三、四季度波浪上升3個階段，布倫特油價兩年來首次突破60美元/桶（見圖1）。

圖2 pH值對于分配系數(shù)的影響

2.2 絡(luò)合劑濃度對丙酸萃取的影響

在pH值為6.0條件下，考察不同濃度（分別為0，0.2 mol/L，0.6 mol/L，1.0 mol/L，1.4 mol/L，1.8 mol/L）MTAC對20 g/L丙酸水溶液的萃取情況（圖3）。在一定MTAC濃度范圍內(nèi)，萃取平衡分配系數(shù)Kd值隨著萃取劑濃度的升高而增大。但濃度過高導(dǎo)致有機相黏度增加，分配系數(shù)值提高幅度不明顯，選擇1.2 mol/L的MTAC為宜。

圖3 絡(luò)和劑濃度對丙酸萃取的影響

2.3 乙酸、琥珀酸對丙酸萃取的競爭

前期研究表明，P. freudenreichii CCTCC M207015發(fā)酵生產(chǎn)丙酸（PA）的同時，還伴有其它副產(chǎn)物乙酸（AA）、琥珀酸（SA）的形成[7－8]，因此需要考察這兩種有機酸對絡(luò)合萃取丙酸的競爭性情況。在pH值為6.0情況下，比較萃取劑對10 g/L丙酸水溶液、10 g/L乙酸水溶液、10 g/L琥珀酸水溶液及有機酸混合溶液（丙酸20 g/L、乙酸10 g/L、琥珀酸5 g/L）的萃取情況（圖4）。

圖4 乙酸、琥珀酸對丙酸萃取的影響

結(jié)果表明，3種有機酸Kd大小順序為丙酸＞琥珀酸＞乙酸，而對有機酸混合溶液的萃取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取劑對丙酸具有較好的選擇性。研究表明，胺類絡(luò)合萃取劑的萃取效果與羧酸的酸性、親油性和萃取劑的性質(zhì)有關(guān)[23－25]。比較各種有機酸的物性參數(shù)發(fā)現(xiàn)，丙酸、乙酸的萃取分配系數(shù)大小順序與它們的親油性參數(shù)（lgP）順序一致，兩者的酸性相差很小，影響萃取效率的主要因素是兩者親油性參數(shù)的差異；琥珀酸和乙酸的酸性和親油性差別均較小，兩者萃取分配系數(shù)相當(dāng)。

2.4 丙酸萃取的鹽效應(yīng)

實際的丙酸發(fā)酵液體系成分復(fù)雜，膜透過液中含有培養(yǎng)基組分以及菌體代謝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物等，這些雜質(zhì)的存在，特別是無機陰離子的存在會對實際的萃取過程產(chǎn)生影響[26]。為此，采用丙酸-無機鹽-萃取劑模擬體系（丙酸20 g/L，乙酸10 g/L，琥珀酸5 g/L，pH值6.0），考察無機陰離子Cl－和SO42－離子（添加量分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%，質(zhì)量體積比）對萃取劑MTAC-正辛醇萃取丙酸過程中產(chǎn)生的影響進行了研究[Cl－和SO42－分別由NaCl和（NH4）2SO4提供]。圖5表明，分配系數(shù)隨著無機陰離子濃度的增加有所下降。由于體系中同時存在著兩種離子對締合過程[式（3）和式（4）]。

式中，X－表示無機陰離子Cl－和SO42－。無機陰離子的存在對MTAC與丙酸根締合形成了一定的競爭，實際發(fā)酵液中Cl－濃度≤0.3%，SO42－濃度≤0.5%，因此，無機陰離子的存在對丙酸萃取過程有一定的影響，Cl－對于丙酸萃取過程影響大于SO42－。

圖5 無機陰離子對有機酸萃取的影響

圖6 相比對萃取的影響

2.5 實際丙酸發(fā)酵液萃取條件的優(yōu)化

2.5.1 相比對萃取的影響

采用1.2 mol/L MTAC-正辛醇萃取實際丙酸發(fā)酵液（丙酸20.2 g/L，乙酸8.5 g/L，琥珀酸4.8 g/L，pH值6.0），考察有機相與水相的體積比對萃取的影響。圖6表明，隨著相比的增大，萃取率相應(yīng)提高，有機相/水相（體積比）為3∶1是較佳的相比選擇。

2.5.2 萃取平衡動力學(xué)曲線

為了確定萃取劑對實際丙酸發(fā)酵液（丙酸20.2 g/L，乙酸8.5 g/L，琥珀酸4.8 g/L，pH值6.0）的萃取平衡時間，實驗測定了1.2 mol/L MTAC-正辛醇萃取體系對丙酸發(fā)酵液萃取的分配系數(shù)與時間曲線（有機相體積與水相體積比為3∶1）。從圖7可以看出，萃取劑MTAC-正辛醇對丙酸發(fā)酵液中丙酸、乙酸和琥珀酸的萃取可在15 min左右達到萃取平衡。

2.5.3 丙酸初始濃度對萃取的影響

圖7 萃取時間對分配系數(shù)的影響

圖8 丙酸初始濃度對萃取的影響

對FBB發(fā)酵所得的丙酸發(fā)酵液進行萃取研究，其中丙酸約52.0 g/L，乙酸9.2 g/L，琥珀酸8.9 g/L。對不同濃度丙酸發(fā)酵液對萃取的影響進行考察。如圖8所示，在考察的丙酸濃度范圍內(nèi)（20～52.0 g/L），萃取劑對丙酸的萃取分配系數(shù)受丙酸濃度影響不大，Kd穩(wěn)定在1.0左右，這說明該萃取劑同樣適用于萃取較高濃度的丙酸發(fā)酵液。

2.5.4 丙酸發(fā)酵液的多級萃取

在有機相與水相體積比為3∶1的條件下，利用1.2 mol/L MTAC-正辛醇對丙酸發(fā)酵液（丙酸52.0 g/L，乙酸9.2 g/L，琥珀酸8.9 g/L，pH值6.0）進行多級萃取，結(jié)果見表1。通過四級萃取，丙酸總萃取率達到86.2%。

表1 丙酸發(fā)酵液多級萃取

3 結(jié) 論

經(jīng)過絡(luò)合劑和稀釋劑篩選，與TOC-正辛醇體系體系相比，MTAC-正辛醇體系受pH值影響較小。無機陰離子對于丙酸萃取有一定影響，Cl－對于丙酸萃取過程影響大于SO42－。當(dāng)萃取體系中存在乙酸、琥珀酸時，該萃取體系對于丙酸具有較高的選擇性，適用于發(fā)酵液中丙酸的萃取。以1.2 mol/L的MTAC為萃取相，有機相/水相（體積比）為3∶1的條件下，15 min即能達到萃取平衡；該系統(tǒng)適用于較高濃度丙酸發(fā)酵液萃取，經(jīng)四級萃取丙酸萃取率達86.2%，能較好地滿足丙酸分離的要求，本研究對于丙酸提取具有較強的參考價值。

[1] Kerjean J R，Condon S，Lodi R，et al．Improving the quality of European hard-cheeses by controlling of interactions between lactic acid bacteria and propionibacteria[J]．Food Res. Int.，2000，33：281-287．

[2] Woskow S A，Glatz B A．Propionic acid production by a propionic acid-tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici in batch and semicontinuous fermentation [J]．Appl. Environ. Microbiol.，1991，57（10）：2821-2828．

[3] Huang Y L，Wu Z，Zhang L，et al．Production of carboxylic acids from hydrolyzed corn meal by immobilized cell fermentation in a fibrous-bed bioreactor [J]．Bioresour. Technol.，2002，82：51-59．

[4] Yang S T，Zhu H，Li Y，et al．Continuous propionate production from wheypermeate using a novel fibrous bed bioreactor[J]．Biotechnol. Bioeng.，1994，43：1124-1130．

[5] Jin Z，Yang S T．Acetate production from whey lactose using coimmobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fibrousbed bioreactor [J]．Biotechnol. Progr.，1998，14：457-465．

[6] Rickert D A，Glatz C E．Improved organic acid production by calcium alginate immobilized propionibacteria[J]．Enzyme. Microb. Technol.，1998，22：409-414．

[7] 馮小海，吳波，沈曉波，等．利用纖維床反應(yīng)器固定化發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的初步研究[J]．生物工程學(xué)報，2008，24（6）：1075-1079．

[8] Feng X H，Xu H，Yao J，et al．Kinetic analysis and pH control strategy for propionic acid production with Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015[J]．Appl. Biochem. Biotechnol.，2010，160（2）：343-349.

[9] 徐虹，馮小海，李凱，等．一種發(fā)酵生產(chǎn)丙酸、丁酸、琥珀酸的固定化纖維床反應(yīng)器：中國，101182456A[P]．2008-05-21．

[10] 徐虹，馮小海，姚忠，等．一種纖維床反應(yīng)器與膜分離技術(shù)聯(lián)用高密度生產(chǎn)有機酸的裝置：中國，101182457A[P]．2008-05-21．

[11] 徐虹，馮小海，章燕，等．一種纖維床反應(yīng)器與萃取分離耦合生產(chǎn)丙酸的裝置及工藝：中國，101182455A[P]．2008-05-21．

[12] Suwannakham S，Yang S T．Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous-bed bioreactor[J]．Biotechnol. Bioeng.，2005，91（3）：325-337．

[13] Paik H D，Glatz B A．Propionic acid production by immobilized cells of a propionate-tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici [J]．Appl. Microbiol. Biotechnol.，1994，42（1）：22-27．

[14] 張華峰，儀宏，陳天華．離子交換法提取發(fā)酵液中丙酸的初步探討[J]．中國飼料，2005，15（4）：12-14．

[15] Gu Z，Glatz B A，Glatz C E．Propionic acid production by extractive fermentation. I. Solvent considerations[J]．Biotechnol. Bioeng.，1998，57（4）：454-461．

[16] Solichien M S，Brien D O，Hammond E G， et al．Membrane-based extractive fermentation to produce propionic and acetic acids：Toxicity and mass transfer considerations[J]．Enzyme. Microb. Technol.，1995，17：23-31．

[17] 羅學(xué)輝，秦?zé)?，戴猷元．三烷基胺萃取丙酸的動力學(xué)特性[J]．化學(xué)工程，2003，31（4）：8-11．

[18] 王志華，高自立，孫思修，等．伯胺N1923萃取檸檬酸的研究[J]．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，1992（9）：5-8．

[19] 李振宇，秦?zé)?，戴猷元．三辛胺萃取一元羧酸的平衡?guī)律（Ⅰ）——萃取平衡特性[J]．化工學(xué)報，2004，55（1）：54-58．

[20] 李斌，常志東，王康，等．N1923絡(luò)合萃取丙酸的研究[J]．環(huán)境化學(xué)，2007，26（5）：642-645．

[21] 徐虹，洪厚勝，李莎，等．利用費氏丙酸桿菌NX-4制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12的方法：中國，200710020579.8[P]．2009-04-08．

[22] 章燕，馮小海，李凱，等．絡(luò)合萃取法分離發(fā)酵液中丙酸的研究[J]．化工進展，2008，27（3）：319-323．

[23] Tamada J A，Kertes A S，King C J．Extraction of carboxylic acids with amine extractants（Ⅰ）equilibria and law of mass action modeling[J]．Ind. Eng. Chem . Res.，1990，29（7）：1319-1326．

[24] Hano T，Matsumoto M，Ohtake T，et al．Extraction equilibria of organic acids with tri-n-octylphosphineoxide [J]．J. Chem. Eng. Jpn.，1990，23（6）：734-738．

[25] Eyal A M，Canari R．pH dependence of carboxylic and mineral acid extraction by amine-based extractants：Effect of pKa, amine basicity and diluent properties [J]．Ind. Eng. Chem. Res.，1994，34（5）：1067-1075．

[26] 姚忠，李家璜，韋萍，等．丙酮酸化學(xué)萃取的鹽效應(yīng)[J]．高校化學(xué)工程學(xué)報，2001，15（6）：587-590．

[27] 張瑾，戴猷元．絡(luò)合萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J]．現(xiàn)代化工，2005，25（7）：185-188．

Extraction of propionic acid from fermentation broth by chemical complexation

FENG Xiaohai1，CHEN Fei1，YAO Zhong1，ZHANG Yan2，XU Hong1
（1State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China；2Ningbo Drug Testing Institute，Ningbo 315040，Zhejiang，China）

Extraction of propionic acid by chemical complexation was investigated from simulation solution and fermentation broth. Methyl trioctyl-ammonium chloride（MTAC）diluted with octanol was used for the extraction，which had a higher selectivity for propionic acid over other organic acids and was less affected by pH and inorganic anions. The extraction equilibrium could be reached in 15 min when 1.2 mol/L of MTAC was applied with an extraction phase ratio of 3∶1（organic phase to water phase）. This system was believed to be adaptable for the extraction of propionic acid with high concentration. Over four-stage extraction，86.2% of propionic acid could be extracted.

propionic acid；complex extraction；methyl trioctyl-ammonium chloride

O 658.2

A

1000–6613（2010）05–0812–05

2009-10-15；修改稿日期：2009-11-12。

國家973計劃（2007CB714304）、江蘇省博士后基金（0901011C）、江蘇省普通高校研究生科技創(chuàng)新計劃（CX08B-113Z）及南京工業(yè)大學(xué)學(xué)科基金項目。

馮小海（1982—），男，博士后。聯(lián)系人：徐虹，教授，博士生導(dǎo)師。電話 025-83172061；E-mail xuh@njut.edu.cn。