不同飼喂方式對生長豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量以及肉嫩度的影響

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 張 勇 劉婷婷 朱宇旌

隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對畜禽肉產(chǎn)品的瘦肉率和肉品質(zhì)要求越來越高。一般瘦肉率主要體現(xiàn)在肌肉生長上，而肉的嫩度在很大程度上影響肉質(zhì)。畜禽宰殺后，肌肉會變僵硬，過一段時間后，則會變得鮮嫩多汁，這個過程稱之為肉的嫩化過程。在這個過程中，鈣蛋白酶系統(tǒng)起著關(guān)鍵的作用，其中鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）是高效且十分專一的鈣蛋白酶（calpain）活性抑制蛋白，通過基因調(diào)控技術(shù)可以提高其在肌肉組織中的表達(dá)來抑制鈣蛋白酶的活性，從而達(dá)到提高肌肉生長的目的。肉的嫩化與鈣蛋白酶的活性有關(guān)，因此可以通過激活鈣蛋白酶或降低鈣蛋白酶抑制蛋白活性的方式提高肉的嫩度，改善肉質(zhì)。本試驗(yàn)旨在研究不同的飼養(yǎng)方式對豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量的影響及其與肌肉嫩度的關(guān)系，為以后進(jìn)一步研究鈣蛋白酶系統(tǒng)與肉品質(zhì)的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計 選擇日齡，胎次，體重相近，身體健康杜×長×大三元雜交生長肥育去勢公豬54頭，豬平均體重60 kg左右開始試驗(yàn)，隨機(jī)分為3個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬。其中第1個處理為對照組（自由采食），第2個處理為限飼組，限飼30%，第3個處理為補(bǔ)償生長組（前20 d限飼30%，后20 d自由采食）。預(yù)飼期1周，試驗(yàn)期40 d，40 d后進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，在第13～16骨間取豬背最長肌樣本，肌肉樣本迅速用液氮冷凍。-80℃保存。

1.2 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)日糧為自配料，參照NRC（1998）中60～90 kg豬的營養(yǎng)需要進(jìn)行日糧設(shè)計，具體組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)豬均采食干粉料，自由飲水，不供應(yīng)青料。預(yù)飼期間所有豬均自由采食，并按正式試驗(yàn)要求計算每天耗料量，試驗(yàn)期限飼組按照自由采食組的70%飼喂，所有豬每天喂3次，分別為 07∶00、11∶30 和下午 5∶30 點(diǎn)，且 3 d 調(diào)整一次限飼組日采食量。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 肉嫩度（剪切力）的測定 取第13～16胸椎部背最長肌一段，將試樣肉表面附著的脂肪除去，裝入塑料薄膜袋中包扎好，放在15～16℃條件下24 h進(jìn)行尸僵前處理。然后將肉樣置于冰箱冷藏層，在4℃條件下熟化24 h。取出完成熟化的肉樣，在室溫下放置1 h。然后，打開塑料薄膜包裝袋，用溫度計插入肌肉中心部，再包扎好肉樣，保持袋口向上，放入80℃恒溫水浴鍋中，加蓋后持續(xù)加熱，直至肌肉中心溫度達(dá)到70℃為止。取出肉樣，放置于室溫下使肌肉冷卻至20℃?zhèn)溆?。將冷卻至20℃肉樣，按與肌纖維呈垂直方向切取寬度為1.5 cm的肉片，再用1.27 cm直徑的圓形取樣器順肌纖維方向鉆切肉樣塊，做10個重復(fù)。記錄10個肉塊的剪切力值，計算算術(shù)平均數(shù)，單位用牛頓（N）表示。

1.5 用Western Blotting檢測豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量

1.5.1 提取蛋白質(zhì)并測定其濃度 使用蛋白質(zhì)提取試劑盒（購自利普萊基因技術(shù)公司），先將肌肉從-80℃冰箱中取出后立即放入經(jīng)滅菌的研缽中，加入液氮后將肉樣研碎，裝入10 mL離心管中-80℃冷凍保存。稱取大約100 mg的肌肉樣品，放入2 mL的離心管中，加入0.8 mL的蛋白裂解液，用組織勻漿機(jī)將肉樣勻漿。取0.5 mL勻漿液加入1 mL蛋白質(zhì)提取液，混勻室溫靜置10 min。 4℃，10000 r/min離心 10 min，用針管將液體吸出，將蛋白膜晾干。分別加2%的SDS約400 μL于各管中，沸水中煮10 min，將蛋白質(zhì)完全溶解變性，4℃過夜。最后12000 r/min常溫離心蛋白質(zhì)溶液10 min，將不溶性沉淀離心出來，取上清液放入-80℃冰箱中保存待用。蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍(lán)法測定 （購自碧云天蛋白質(zhì)測定試劑盒）。

1.5.2 SDS-PAGE電泳 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可對蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離 （電泳槽用上海天能生產(chǎn)VE-180垂直板電泳槽）。每個加樣孔的加樣量統(tǒng)一為6 μg。10%分離膠（ddH2O 1.9 mL；30%Acr/Bis 1.7 mL；1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）1.3 mL；10%SDS 0.05 mL；10%過硫酸銨 0.05 mL；TEMED 0.002 mL），濃縮膠的濃度為5%[（ddH2O 1.4 mL；30%Acr/Bis 0.33 mL；1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）0.25 mL；10%SDS 0.02 mL；10%過硫酸銨 0.02 mL；TEMED 0.002 mL）]；跑膠時恒壓濃縮膠中電壓80 V，分離膠中電壓100 V。

1.5.3 轉(zhuǎn)膜 將凝膠上的蛋白質(zhì)用電轉(zhuǎn)移槽 （上海天能Tanon，VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽）轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（NC膜），轉(zhuǎn)膜在冰水浴的條件下進(jìn)行，恒流100 mA轉(zhuǎn)移90 min。此過程是試驗(yàn)中最為關(guān)鍵的一步。

1.5.4 封閉及抗體的孵育將轉(zhuǎn)移完蛋白質(zhì)的NC膜用脫脂奶粉配制的5%的封閉液37℃封閉2 h，然后用封閉液稀釋的鈣蛋白酶抑制蛋白抗體（1∶5000）2 mL，搖床上孵育 NC 膜，時間為 2 h（鈣蛋白酶抑制蛋白抗體為Abcam公司生產(chǎn)的鼠單克隆抗體）。然后用TBST緩沖液漂洗膜4次，每次10 min。再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG第二抗體（1∶8000）孵育 NC膜，與一抗反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)。反應(yīng)時間為1 h（第二抗體購自天根生化科技有限公司）。然后用TBS漂洗液漂洗二抗3次，每次10 min。

1.5.5 底物顯色及結(jié)果處理 用底物顯色法使鈣蛋白酶抑制蛋白顯色，所用顯色劑是二甲基聯(lián)苯胺（DAB）。顯色后的NC膜用掃描儀掃描，然后用用捷達(dá)JD801凝膠成像與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理和灰度掃描，得出鈣蛋白酶抑制蛋白的IOD值。

1.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼喂方式對肉嫩度的影響 見表2。

表2 不同飼養(yǎng)方式下對豬肉剪切力值的影響

表2顯示：剪切力補(bǔ)償生長組比自由組提高13.32%（P>0.05），限飼組比補(bǔ)償生長組提高13.29%（P<0.05），限飼組比自由組提高28.38%（P<0.01）。

2.2 不同飼養(yǎng)方式對豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量影響 見圖1和表3。

表3 不同飼養(yǎng)方式對豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量的影響

圖1為6張掃描后的NC膜，結(jié)果顯示為54頭試驗(yàn)豬背最長肌中的鈣蛋白酶抑制蛋白，其中每張片子上有9條蛋白印記，這9條蛋白質(zhì)印記分別代表9頭豬的鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量。自由、補(bǔ)償生長、限飼組各3頭豬，其中1、2、3為自由采食組，4、5、6 為補(bǔ)償生長組，7、8、9 為限飼組。

表3顯示，鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量補(bǔ)償生長組比自由組提高59.53%（P<0.05），限飼組比補(bǔ)償生長組高34.98%（P<0.05），限飼組比自由組提高 115.33%（P<0.01）。

2.3 鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量與肌肉剪切力的相關(guān)性 見圖2。

圖2顯示，鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量與肌肉剪切力相關(guān)性不顯著（P>0.05），但呈上升趨勢。

3 討論

3.1 不同飼養(yǎng)方式對肌肉嫩度的影響 肉的嫩度是指肉在食用時口感的老或嫩，反映了肉的質(zhì)地，由肌肉中各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性決定。對肉嫩度的評價主要根據(jù)其柔軟性、易碎性、可咽性來判定。這些都是由人的口來感覺評判的，但也可以通過儀器來評價，如剪切力。肉的嫩度受飼養(yǎng)、營養(yǎng)及宰后加工、儲存等多種因素的影響。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者對不同飼喂方式對肉嫩度的影響進(jìn)行了研究。汪堯春（1996）研究表明，限飼不利于肉嫩度和多汁性的提高。Ellis等（1996）報道，限飼降低了肉的嫩度、多汁性和（或）風(fēng)味。Lametsch等（2006）認(rèn)為，補(bǔ)償生長后豬肉嫩度顯著增加。

本試驗(yàn)表明，以自由組為對照，補(bǔ)償生長組和限飼組的剪切力依次升高，并且補(bǔ)償生長組和自由組差異不顯著，限飼組和補(bǔ)償生長組差異顯著，而限飼組和自由組差異極顯著。也就是說限飼極顯著降低了豬肉的嫩度，而補(bǔ)償生長可顯著改善這種狀況。這與許多前人的研究結(jié)果相似，改變飼喂方式可以作為調(diào)節(jié)肉嫩度的一種方法，但不是最好的方法。

3.2 不同飼養(yǎng)方式對背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量的影響 國內(nèi)外關(guān)于不同飼喂方式對鈣蛋白酶抑制蛋白在豬背最長肌中蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響鮮有報道。Higgins等（1988）研究發(fā)現(xiàn)，羔羊飼喂高于其維持需要的營養(yǎng)對其鈣蛋白酶系統(tǒng)無影響；Thomson等（1992）報道，限制采食使羔羊μ-鈣蛋白酶/鈣蛋白酶抑制蛋白活性顯著升高，從而后肢蛋白質(zhì)降解速度顯著升高；然而禁食使斷奶羔羊μ-鈣蛋白酶/鈣蛋白酶抑制蛋白活性顯著降低，但后肢蛋白質(zhì)降解速度仍顯著升高。Thomson等（1997）認(rèn)為，營養(yǎng)水平對斷奶閹公羊骨骼肌鈣蛋白酶系統(tǒng)活性均無影響，但肌肉蛋白質(zhì)沉積速度與鈣蛋白酶抑制蛋白活性呈正相關(guān)，肌肉蛋白質(zhì)降解速度與μ-鈣蛋白酶活性呈負(fù)相關(guān)。禁食使兔肌肉蛋白降解增加2倍，鈣蛋白酶抑制蛋白mRNA水平增加312倍，但活性均無變化（Higgins等，1988）。由本試驗(yàn)可見，與自由采食組相比，背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量補(bǔ)償生長組、限飼組依次顯著上升，且補(bǔ)償生長組和自由采食組，限飼組和補(bǔ)償生長組差異顯著，而限飼組和自由采食組差異極顯著。也就是說限飼可顯著增加鈣蛋白酶抑制蛋白的蛋白表達(dá)量，加強(qiáng)了翻譯水平。

3.3 豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量與肌肉剪切力的相關(guān)性 嫩度是決定肌肉食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。肌肉內(nèi)結(jié)締組織、肌間脂肪及保水性等和肌肉的嫩度均有一定的相關(guān)性，但不是影響肌肉嫩度的主要因素，而宰后肌肉在成熟過程中，骨架蛋白的降解對嫩度的提高起主導(dǎo)作用。Taylor等（1995）等發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的鈣激活蛋白酶系對肌肉骨架蛋白的降解有重要的作用，試驗(yàn)用鈣激活蛋白酶的提取液處理分離的肌原纖維，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌原纖維的Z線崩潰并逐漸消失，很大程度上削弱了肌原纖維，同時肉的嫩度也得以大大提高。目前，大量的研究已證實(shí)；鈣激活蛋白酶系廣泛存在于各組織中，與動物的生長速度和宰后肌肉的嫩化有著密切的關(guān)系。

本試驗(yàn)對鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量和肌肉剪切力做了相關(guān)回歸分析，隨著鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量的增多，剪切力值就越大，肉的嫩度越差，這與許多前人的研究結(jié)果相似。Kristensen等（2002）研究認(rèn)為，m-鈣蛋白酶涉及豬肉生長，而μ-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的宰后活性與豬肉的嫩化作用有關(guān)。Melody等（2004）研究表明，鈣蛋白酶及其抑制蛋白與肌肉發(fā)育之間存在著密切相關(guān)，鈣蛋白酶抑制蛋白能提高肌肉的嫩度值，而肌原纖維又占成熟骨骼肌蛋白重量的50%～60%，所以通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的活性可調(diào)節(jié)肌肉的發(fā)育，從而提高家畜的瘦肉率和產(chǎn)出率，提高肌肉的質(zhì)量。Koohmaraie 和 Geesink（2006）研究認(rèn)為，高水平的鈣蛋白酶抑制蛋白能抑制宰后肌肉蛋白水解和嫩化，μ-鈣蛋白酶作用于宰后肌肉蛋白水解和嫩化是間接性的。

近年來，對鈣蛋白酶抑制蛋白與肉嫩度相關(guān)性進(jìn)行了一系列研究。孫立彬等（2005）對125頭雜交豬進(jìn)行屠宰測定，通過鈣蛋白酶抑制蛋白基因型與屠體性狀、肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析，得出鈣蛋白酶抑制蛋白基因?qū)?nèi)脂肪含量具有顯著影響。證明了鈣蛋白酶抑制蛋白基因是一個對肉質(zhì)相關(guān)性狀非常有用的候選基因。程豐等（2006）發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶抑制蛋白基因的一定基因型與豬肉的嫩度存在相關(guān)性，鈣蛋白酶抑制蛋白基因存在Ras1、msp1、Hinf1等內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，為鈣蛋白酶抑制蛋白基因作為豬肉嫩度的候選基因奠定了基礎(chǔ)。楊曉慧等（2006）對萊蕪豬、大白豬、杜洛克和商品雜交豬的鈣蛋白酶抑制蛋白Ser638Arg突變位點(diǎn)的多態(tài)性分析，證實(shí)Ser638Arg突變可能促進(jìn)鈣蛋白酶抑制蛋白的磷酸化，從而影響豬屠宰后肌肉的蛋白質(zhì)水解。武艷群等（2007）研究了鈣蛋白酶抑制蛋白基因限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）與金皮F2代豬眼肌面積、眼肌系水力和眼肌導(dǎo)電率等屠宰性狀的關(guān)系。結(jié)果顯示，ABCDEF基因型個體比BBDDFF基因型個體眼肌面積小12.42%，從而進(jìn)一步證明了鈣蛋白酶抑制蛋白基因是一個與肉質(zhì)相關(guān)性非常高的候選基因。

4 結(jié)論

4.1 不同的飼喂方式對背最長肌的剪切力值影響顯著，與自由采食組相比，對豬采取限制飼養(yǎng)的方式，極顯著降低了豬肉的嫩度，而先限飼后補(bǔ)償生長可以顯著改善這種狀況。

4.2 不同的飼喂方式導(dǎo)致背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量不同，與自由采食組相比，限飼組極顯著提高了鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量，加強(qiáng)了鈣蛋白酶抑制蛋白的翻譯水平。

4.3 背最長肌肌肉剪切力值隨背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白的表達(dá)量增多而有增加的趨勢。

4.4 綜上所述，自由采食時，肥育豬背最長肌中鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量較少，嫩度較好。而限飼使鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量增多，降低了肉的嫩度。

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